兩種方法制備豬小腸黏膜下層重建SD大鼠前交叉韌帶力學對比研究

陳飚

摘要目的：比較兩種方法制作的豬小腸黏膜下層的力學性能。方法：用物理及化學方法處理豬小腸黏膜下層，并分別用編織（A組）和軸卷（B組）兩種方法制備。移植重建SD大鼠前交叉韌帶，3個月后應用試驗機對兩組不同方法制作的豬小腸黏膜下層進行力學性能檢測。結(jié)果：A組最大拉伸強度明顯強于B組，差異有統(tǒng)計學意義（1=2.9660，P<0.05）。結(jié)論：編織豬小腸黏膜下層的抗拉強度大于軸卷組。

關鍵詞 小腸黏膜下層;重建;前交叉韌帶;力學;對比研究

小腸黏膜下層（SIS）是天然不含細胞的細胞外基質(zhì)類材料，在組織工程的支架材料領域有較多成功應用經(jīng)驗1-1。它是從豬小腸中提取出來的一種生物活性膜，具有多功能、多分化而且容易分離等特點，厚度僅0.1mm，主要成分為細胞外基質(zhì)，主要由膠原和水構(gòu)成1-。其作為生物工程材料已廣泛應用，但其力學強度仍存在一定差異。本實驗通過兩種不同方法制作豬SIS（編織和軸卷），并測試兩者力學性能，以尋找一種增加其強度的制作方法。

資料與方法

材料與分組：取新鮮豬小腸若干，通過以下方法制取SIS，并對其進行分組，A組為編織組，B組為軸卷組。每組選取20個標本進行力學性能檢測。

方法：①SIS制備：取新鮮豬小腸，自十二指腸遠端10cm起取100cm長，按每段10cm進行橫行切斷，縱向剖開小腸，使?jié){膜層置于0.9%氯化鈉溶液浸濕的紗布上，黏膜層朝上。用紗布包裹手術(shù)刀柄，刮除小腸表面黏膜層，邊刮除邊用0.9%氯化鈉溶液進行沖洗，見該面為乳白色半透明基膜樣組織時將小腸翻轉(zhuǎn);同樣方法刮除小腸肌層和漿膜層，同樣邊刮除邊沖洗，全部刮除干凈后將SIS放置于0.9%氯化鈉溶液中清洗后以化學方法處理其殘留的其他細胞組織。將以上已用物理方法處理后的SIS用Abraham法進行化學處理"，將SIS置于含EDTA100mmol/L和NaOH10mmol/L的混合溶液，pH=11，浸泡16h。取出后用去離子水沖洗干凈，置于含HCl和NaCl的混合溶液（pH=0.5）中，濃度均為1mmol/L，浸泡6～8h。取出后同樣采用去離子水沖洗干凈，置于含NaCl1mmol/L的PBS中浸泡16h。取出后以去離子水沖洗干凈，在PBS（pH=7.4）中浸泡2h。取出后用去離子水沖洗。殺菌：SIS在含1%過氧乙酸的體積分數(shù)20%乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05%疊氮化鈉的PBS清洗2h。程序性降溫到一80C，凍干后真空包裝。以"Coγ射線25～35kGy照射消毒。殘留細胞計數(shù)：分別對上述經(jīng)物理和化學處理后的SIS取多個樣本，在光學顯微鏡下進行殘留細胞計數(shù)。將每塊SIS膜沿小腸縱軸方向?qū)Π爰糸_，一半沿小腸橫軸軸卷，卷成圓柱狀，直徑約2mm，其終末外緣用11-0縫線間斷縫合固定，防止其松散，即B組（軸卷組）SIS制作完成;A組（編織組）制作方法：將剩余一半小腸SIS膜進行對折2～3次，將4個角稍固定，由小腸尾側(cè)向頭側(cè)均等做3等份剪開，頭側(cè)保留約5mm，將剪后形成的3束SIS膜進行編織，末端用11-0縫線縫合固定。②重建韌帶及力學檢測：選取20只SD大鼠雙側(cè)后肢膝關節(jié)，左側(cè)采用編織組（A組）進行重建;右腿采用軸卷組（B組）重建前交叉韌帶，使用氯胺酮按20～25mg/kg劑量進行腹腔注射麻醉，麻醉滿意后雙后肢膝關節(jié)備皮、消毒，固定四肢及門齒，手術(shù)于膝關節(jié)正中行直切口，顯露關節(jié)腔，采用直徑2.0mm克氏針于脛骨與股骨前交叉韌帶起、止點處做骨隧道，將帶線導針穿入骨隧道，帶線將各SIS牽引人骨隧道內(nèi)，重建韌帶，調(diào)節(jié)其張力，兩頭分別用縫線縫合于骨質(zhì)上固定，清洗傷口，縫合、包扎。術(shù)后以小夾板固定后肢于伸直位。術(shù)后以每3d拆除小夾板，觀察傷口愈合情況、有無感染，2周后拆線，3周后拆除小夾板，允許自由活動。3個月后注射空氣處死大鼠，將雙后肢離斷，分離顯露股骨和脛骨，祛除周圍軟組織，僅保留前交叉韌帶使股骨和脛骨相連，采用島津AG20KNA材料試驗機對其進行力學測試，記錄相應結(jié)果。

統(tǒng)計學方法：各組數(shù)據(jù)應用SPSS15.0軟件處理，計量資料用（±）表示，采用1檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果

動物大體情況：20只SD大鼠均成活，其中曾出現(xiàn)傷口紅腫，但無化膿3只，經(jīng)嚴密制動觀察后紅腫消退。傷口縫線大多2周時自行脫落，未脫落者予拆線處理。術(shù)后6～8周基本均可正常爬行，術(shù)后3個月爬行、奔跑與正常大鼠無明顯異常。檢查雙后肢膝關節(jié)穩(wěn)定性良好，無明顯脫位或半脫位現(xiàn)象。處死大鼠，解剖大鼠見關節(jié)植人SIS于術(shù)后3個月時均與大鼠骨質(zhì)愈合，其連續(xù)性良好，表面可見一層新生滑膜樣組織。觀察SIS，其內(nèi)部為較致密纖維樣組織。

SIS拉伸力學測試：SIS力學檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A組最大拉伸強度明顯強于B組，差異有統(tǒng)計學意義（1=2.9660，P<0.05），見表1。

討論

SIS由豬SIS經(jīng)去細胞、化學交聯(lián)等處理制備而成，屬天然細胞外基質(zhì)類材料，其主要成分是膠原（含量>90%），有一定的機械強度，還含有一定的硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、纖維黏蛋白和多種細胞因子，因此無免疫原性，生物相容性好，具有一定的抗微生物活性和部位特異的組織再生能力回，是目前最有可能實現(xiàn)組織體內(nèi)再生性修復的材料之一。作為異基因支架材料，在>1000種的跨種交叉移植實驗中均表現(xiàn)無免疫原性”。本實驗中動物術(shù)后情況未見明顯排斥反應，僅3只大鼠曾出現(xiàn)傷口紅腫，經(jīng)制動觀察后紅腫漸漸消退?？紤]為手術(shù)創(chuàng)傷后炎性反應，經(jīng)制動休息后紅腫癥狀消退。

研究發(fā)現(xiàn)，在羊動物模型上用SIS修復前交叉韌帶圖，SIS組無異基因臨床表現(xiàn)，術(shù)后早期SIS組有混合炎性反應，SIS支架有巨細胞和淋巴細胞，后期消失，說明SIS可作為修復肌腱、前交叉韌帶的良好的生物材料。其實驗結(jié)果在術(shù)后3個月時與本實驗結(jié)果基本相當，而A組結(jié)果其強度明顯強于B組，說明通過編織方法可加強其拉伸強度，但對肢體膝關節(jié)整體穩(wěn)定性與A組并無顯著差異。本實驗通過SIS對SD大鼠前交叉韌帶重建，重建后SIS存在于骨與骨之間的距離僅僅約1cm長，若將其游離切斷則無法進行下一步的力學測試，從而選擇切取整個膝關節(jié)，將股骨與脛骨之間的連接組織切斷，僅剩重建后的前交叉韌帶，通過股骨與脛骨之間的拉伸來檢測重建后SIS的力學強度，該方法科學、合理，所得結(jié)果可信，誤差小。

近年來隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用組織工程方法對前交叉韌帶進行重建也逐漸成為新的研究熱點，為前交叉韌帶損傷的治療提供了新途徑！。目前研究的種子細胞有成纖維細胞、韌帶細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞，成纖維細胞和韌帶細胞因體外培養(yǎng)植入后排斥反應或多次傳代后增殖能力下降而不能獲得良好效果，骨髓間充質(zhì)干細胞雖不存在上述缺陷，但因在目前體外培養(yǎng)條件下難以做到讓其定向誘導向韌帶細胞分化"，本實驗并未在組織材料里添加細胞，同樣獲得較好機械強度，實驗結(jié)果與用豬SIS修復犬肩袖韌帶損傷的實驗結(jié)果相似！"，其術(shù)后6個月行組織學檢測顯示無異物或免疫學反應的組織學表現(xiàn)，與周圍組織無粘連，再生肌腱與天然肌腱的力學強度相比差異無統(tǒng)計學意義。分析其原因為膠原可通過調(diào)節(jié)化學物質(zhì)的流動、細胞受到的機械刺激來對細胞的分化和形態(tài)進行調(diào)節(jié)，是正常組織中細胞黏附和遷移的支架。本實驗中，膝關節(jié)內(nèi)前交叉韌帶和后交叉韌帶是緊密相依的，當在屈伸活動的過程中受到機械刺激，正常組織中細胞在其上進行黏附、遷移、增殖，經(jīng)長時間修復后同樣可以達到穩(wěn)定關節(jié)的作用。

SIS可以單純用于組織缺損的修復，已得到肯定”，本實驗再次證明可以單純使用SIS修復重建前交叉韌帶，并且在使用編織方法制作SIS重建韌帶后其拉伸強度更強。但對大型動物是否適用需進一步實驗研究。

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