丹參葉片離體培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化

申順先 李學(xué)慧 梁明勤

摘要：以丹參葉片為外植體，利用正交試驗(yàn)等方法篩選優(yōu)化丹參葉片不定芽誘導(dǎo)、不定芽叢增殖及壯苗生根、不定根毛狀根誘導(dǎo)的適宜方案。結(jié)果表明：適宜葉片不定芽誘導(dǎo)的配方是MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+瓊脂 6.5 g/L;不定芽叢增殖的最適配方是2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，平均芽增殖系數(shù)達(dá)12.00;適宜幼苗產(chǎn)生根的配方是1/2 MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，生根率達(dá)100%;適宜葉片誘導(dǎo)不定根毛狀根的配方是MS+0.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

關(guān)鍵詞：丹參;葉片離體培養(yǎng);不定芽;毛狀根

中圖分類號(hào)： S567.5+30.43? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）12-0070-04

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，以根和根莖入藥[1]，能活血祛瘀，養(yǎng)血安神，具有擴(kuò)張血管、降脂、降壓從而改善微循環(huán)等作用，現(xiàn)常用于心、腦血管等疾病的治療和保健預(yù)防[2]，是我國(guó)十分重要的中藥材。然而由于丹參產(chǎn)地較多[3-4]，加上其為常異花授粉植物[5-6]，種子繁殖中的天然異交引起一定的種性變異，分根或蘆頭繁殖易攜帶病菌引起種性退化[7]，導(dǎo)致丹參原藥質(zhì)量不一，甚至影響臨床療效。丹參組織培養(yǎng)技術(shù)既可以獲得種性一致的脫毒種苗加快優(yōu)質(zhì)種苗的繁殖速度[8]，又可以通過(guò)愈傷組織及毛狀根進(jìn)行藥物有效成分的生產(chǎn)[9-10]，從而避免品種混亂導(dǎo)致藥效下降，為生產(chǎn)大量“血統(tǒng)純正”的丹參原藥奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以丹參無(wú)菌葉片為外植體從不定芽誘導(dǎo)、不定芽叢增殖培養(yǎng)、不定根及毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)等方面進(jìn)行探索，建立并優(yōu)化了丹參葉片離體培養(yǎng)體系，為丹參優(yōu)質(zhì)種苗工廠化生產(chǎn)及毛狀根培養(yǎng)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為無(wú)菌丹參葉片，取自2014年初代培養(yǎng)獲得的紫花丹參無(wú)菌組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片誘導(dǎo)培養(yǎng) 2015年10月至2016年1月期間，采用預(yù)先培養(yǎng)在MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養(yǎng)基（pH值6.0，下同）上的旺盛生長(zhǎng)、健壯一致的丹參無(wú)菌綠苗，取寬 1.5～2.0 cm平展、健康帶葉柄的葉片，從中間主脈附近縱向一剪為二， 接種在MS+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA、2，4-D的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，初步探索葉片離體培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。培養(yǎng)條件（下同）為溫度（25±2） ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，每天光照10 h，培養(yǎng)室空氣相對(duì)濕度70%。第3周統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，第6周統(tǒng)計(jì)不定芽（根）分化率[11]，具體計(jì)算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織的葉片塊數(shù)/接種的葉片塊數(shù)）×100%;

不定芽（根）分化率=[產(chǎn)生不定芽（根）的葉片塊數(shù)/接種的葉片塊數(shù)]×100%。

1.2.2 不定芽叢增殖配方的篩選 2016年5月，以MS培養(yǎng)基的微量鐵鹽和有機(jī)物為培養(yǎng)基基本成分（附加瓊脂 6.5 g/L），對(duì)MS大量元素、6-BA、NAA、GA3和蔗糖濃度進(jìn)行5因素4水平正交試驗(yàn)（表1）。采用預(yù)先在MS+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周的旺盛生長(zhǎng)、健壯一致的丹參無(wú)菌綠苗，取寬1.5～2.0 cm平展、健康帶葉柄的葉片，從中間主脈附近縱向一剪（并不分開），正面向上接種于16個(gè)培養(yǎng)基配方上培養(yǎng)，每個(gè)配方接種4瓶，每瓶接種4張葉片。6周后統(tǒng)計(jì)不定芽叢增殖系數(shù)，計(jì)算公式如下：

不定芽叢增殖系數(shù)=有效芽苗數(shù)/接種葉片數(shù)，注意有效芽苗是指苗高不低于0.5 cm的芽苗。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各項(xiàng)平均值、方差分析采用Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)配方的篩選

2.1.1 葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)中6-BA對(duì)不定芽產(chǎn)生的影響 丹參無(wú)菌葉片在附加不同濃度6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，除 6-BA 濃度為0的配方外，大都在1周前后啟動(dòng)細(xì)胞分裂，1～2周形成愈傷組織，2～3周出現(xiàn)綠色芽體，3周后愈傷組織不再明顯增長(zhǎng)，不定芽分化明顯。由表2可知，不附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基MS不能誘導(dǎo)丹參葉片產(chǎn)生愈傷組織，更不會(huì)出現(xiàn)不定芽的分化。當(dāng)僅附加適當(dāng)濃度的6-BA時(shí)就能誘導(dǎo)葉片切口處產(chǎn)生愈傷組織，并分化出不定芽;但愈傷組織誘導(dǎo)率與不定芽分化率卻隨著6-BA濃度的增高反而降低。因此，丹參葉片誘導(dǎo)不定芽以采用配方MS+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂為好（圖1-A）。

試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在葉柄切口處也易產(chǎn)生愈傷組織，并進(jìn)一步分化出不定芽，但當(dāng)葉柄插入培養(yǎng)基內(nèi)部時(shí)卻很難產(chǎn)生;當(dāng)葉片正面向下背面向上放在培養(yǎng)基上時(shí)，也很難產(chǎn)生愈傷組織。此外，有的芽不經(jīng)愈傷組織階段而直接產(chǎn)生于葉片上。

2.1.2 葉片誘導(dǎo)培養(yǎng)中2，4-D對(duì)不定根及毛狀根產(chǎn)生的影響 丹參無(wú)菌葉片在附加不同濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，除2，4-D濃度為0的配方外，大都能在葉片、葉柄切口處產(chǎn)生愈傷組織，并進(jìn)行根的分化產(chǎn)生根突，快的3周內(nèi)就已經(jīng)產(chǎn)生大量的根。由表3可知，不附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS不能誘導(dǎo)丹參葉片出現(xiàn)不定根的分化;當(dāng)僅附加適當(dāng)濃度的2，4-D時(shí)就能誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，并分化出不定根;但不定根分化率卻隨著2，4-D濃度的增高反而降低。說(shuō)明2，4-D可以誘導(dǎo)丹參葉片產(chǎn)生愈傷組織并分化出不定根，但當(dāng)2，4-D濃度過(guò)高時(shí)抑制不定根的分化?？梢姡⑷~片誘導(dǎo)不定根以附加2，4-D 0.1～0.5 mg/L為佳。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)2，4-D濃度升高至0.25 mg/L及其以上時(shí)會(huì)分化出毛（發(fā)）狀根，0.50 mg/L時(shí)能產(chǎn)生大量毛（發(fā)）狀根（圖1-B）。因此，適宜丹參葉片誘導(dǎo)不定根毛狀根的配方是MS+0.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

綜合以上試驗(yàn)表明，6-BA與2，4-D都能使丹參葉片發(fā)生脫分化產(chǎn)生愈傷組織，但6-BA會(huì)促使愈傷組織進(jìn)一步分化為不定芽，而 2，4-D會(huì)促使愈傷組織進(jìn)一步分化為不

2.2 不定芽叢增殖培養(yǎng)基配方篩選與優(yōu)化

2.2.1 不定芽叢增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)結(jié)果分析 第2周，培養(yǎng)在16個(gè)配方上的丹參葉片均已產(chǎn)生淡綠色粒狀松散愈傷組織，愈傷組織主要產(chǎn)生于葉片及葉柄切口與培養(yǎng)基接觸部位;配方1、2、5、7、9、14、15上的愈傷組織出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。第4周，除配方4、8、12、16上愈傷組織剛開始或正在分化芽外，其他配方均已產(chǎn)生不定芽;此外，配方1、4、10、13上均有一塊愈傷組織產(chǎn)生了1或2條根。第6周，丹參葉片不定芽叢增殖系數(shù)和生長(zhǎng)狀況見表4，可見丹參不定芽分化率除配方4為75%外，其他配方均達(dá)100%;除配方4、8外，其他配方都或多或少地分化出了不定芽叢;增殖系數(shù)除配方3、4、8、12、13、16外，其他配方均不低于10.00倍;增殖系數(shù)最高的是配方6，達(dá)12.00倍，次之的是配方7，達(dá)11.75倍;增殖系數(shù)最低的是配方4，僅為3.56倍。對(duì)不定芽叢增殖系數(shù)高低的影響效應(yīng)由主到次的排序是6-BA、MS大量元素、NAA、GA3、蔗糖（方差分析表明，6-BA、MS大量元素、NAA濃度均差異極顯著，GA3、蔗糖濃度差異顯著），五者引起平均芽增殖系數(shù)最高的水平分別是第2、2、1、1、2水平，即丹參葉片不定芽叢增殖比較適宜的配方是2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+25 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂。

2.2.2 不定芽叢增殖培養(yǎng)基配方對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果分析 因正交試驗(yàn)篩選的適宜配方并不在16個(gè)配方中，故將該配方與正交試驗(yàn)中增殖系數(shù)最高的6號(hào)配方、次高的7號(hào)配方等同時(shí)接種，進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)（表5，各配方附加瓊脂6.5 g/L）。6周后對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果表明，此配方的增殖系數(shù)（9.56）明顯低于原6號(hào)配方（11.85）與原7號(hào)配方（11.90）。綜合正交試驗(yàn)、對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果，并兼顧不定芽苗的健壯程度，認(rèn)為丹參葉片不定芽叢增殖最適的培養(yǎng)基配方是原6號(hào)配方，即2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂（圖1-C）。

2.3 壯苗與生根培養(yǎng)

經(jīng)丹參葉片離體培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽叢，苗高并不整齊，有的苗較大且健壯，有的苗較小且弱。對(duì)于健壯大苗，可以分切后直接接種在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。對(duì)于較小弱苗，可以分切后先接種在MS培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，待苗長(zhǎng)高后可以再轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。生根培養(yǎng)接種于培養(yǎng)基1/2 MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，1周前后就產(chǎn)生白色根，2周生根率達(dá)100%（圖1-D）。

表5 不定芽叢增殖培養(yǎng)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

配方???????? 增殖系數(shù)???????? 不定芽叢生長(zhǎng)狀況

2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+25 g/L蔗糖??????? 9.65 綠色不定芽叢，有的苗較高，但不整齊

2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖??????? 11.85??????? 綠色不定芽叢，苗高與上者持平，也不整齊

2/3 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+25 g/L蔗糖??????? 11.90??????? 綠色不定芽叢，苗高不整齊，較多芽小而密，輕度玻璃化

3 討論與結(jié)論

誘導(dǎo)丹參葉片、葉柄、花蕾等不含芽材料脫分化，經(jīng)器官發(fā)生方式再分化出完整植株是比較容易實(shí)現(xiàn)的[12-14]，但要將其作為丹參種苗生產(chǎn)途徑就需要解決關(guān)鍵問(wèn)題，即不定芽叢增殖最適培養(yǎng)基配方的獲得。為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，本研究采用正交試驗(yàn)等方法從基本培養(yǎng)基大量元素與多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組配著手，篩選并優(yōu)化了丹參葉片不定芽叢增殖培養(yǎng)基配方。

丹參不定芽叢增殖正交試驗(yàn)中，MS基本培養(yǎng)基大量元素濃度差異極顯著，在2/3 MS時(shí)更有利于不定芽叢的增殖。誘導(dǎo)試驗(yàn)中，丹參葉片在MS基本培養(yǎng)基上（無(wú)任何生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑），既不會(huì)產(chǎn)生愈傷組織也不會(huì)產(chǎn)生不定芽和根，在添加0.5 mg/L 6-BA時(shí)，3周愈傷組織誘導(dǎo)率與6周不定芽分化率都達(dá)到了100%，然而這2個(gè)指標(biāo)卻隨著6-BA濃度的進(jìn)一步增高（0.5→1.5 mg/L）反而降低。正交試驗(yàn)中，6-BA濃度差異極顯著，在第2周、第4周、第6周的動(dòng)態(tài)觀察中發(fā)現(xiàn)了有類似的現(xiàn)象，在6-BA濃度由0.25增至0.50 mg/L時(shí)平均芽增殖系數(shù)也隨著增大，而由0.50增至1.00 mg/L時(shí)開始減小，再增至2.00 mg/L時(shí)明顯減小，6-BA濃度均為 2.00 mg/L 的配方4、8、12、16愈傷組織分化不定芽反而較慢;這說(shuō)明低濃度的6-BA會(huì)促進(jìn)芽的分化，而高濃度反而有一定的抑制作用。NAA濃度差異極顯著，平均芽增殖系數(shù)隨著NAA濃度的增高反而減小，這說(shuō)明NAA對(duì)分化芽有一定的抑制作用。這些現(xiàn)象與梁紅等[11]、解曉紅等[15]、蔡朝暉等[16]的發(fā)現(xiàn)是一致的。結(jié)合丹參葉片誘導(dǎo)試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、對(duì)比試驗(yàn)的篩選與優(yōu)化結(jié)果，丹參葉片誘導(dǎo)不定芽叢增殖最適配方是2/3 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L GA3+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，其可以次序有效地誘導(dǎo)出愈傷組織與不定芽叢，甚至直接誘導(dǎo)出不定芽叢，增殖系數(shù)達(dá)12.00倍。增殖培養(yǎng)產(chǎn)生的不定芽苗，經(jīng)壯苗培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接在生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂上，1周前后就產(chǎn)生白色根，2周生根率達(dá)100%。

誘導(dǎo)丹參毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)逐漸成為生產(chǎn)丹參藥理活性物質(zhì)的良好體系[17]，而大多數(shù)研究者是利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化丹參外植體誘導(dǎo)毛狀根的[18-19]，不僅需菌株培養(yǎng)、外植體侵染，而且成功后還要多次轉(zhuǎn)接進(jìn)行除菌培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力;就不如本研究通過(guò)2，4-D直接誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生毛狀根更便利。本研究發(fā)現(xiàn)，MS附加2，4-D 0.1～0.5 mg/L適宜誘導(dǎo)丹參葉片產(chǎn)生愈傷組織并分化出不定根，當(dāng)2，4-D濃度升高至 0.25 mg/L 及其以上時(shí)分化出不定根毛狀根，0.50 mg/L時(shí)產(chǎn)生大量毛狀根，但當(dāng)2，4-D濃度過(guò)高時(shí)卻抑制不定根的分化;MS+0.5 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂就是丹參葉片誘導(dǎo)不定根毛狀根的適宜配方，無(wú)疑這為利用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參活性成分開辟了一條新途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：70-71.

[2]王冰瑤，吳曉燕，樊官偉. 丹參素保護(hù)心血管系統(tǒng)的藥理作用機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2014，45（17）：2571-2575.

[3]趙寶林. 丹參藥材道地性探討[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（12）：3101-3102.

[4]趙 魁，郭曉恒，宋 杰，等. 全國(guó)丹參生產(chǎn)現(xiàn)狀的調(diào)查和分析[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（9）：2307-2310.

[5]李 今. 藥用植物丹參傳粉因子的研究[J]. 首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，22（2）：58-61.

[6]宋振巧，王建華，王洪剛，等. 丹參開花與繁育特性研究[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2009，36（6）：905-910.

[7]李天祥，常廣璐，李國(guó)輝，等. 丹參培育中的關(guān)鍵問(wèn)題和對(duì)策[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，26（12）：3008-3010.

[8]溫春秀，謝曉亮，吳志明，等. 丹參脫病毒及組培快繁技術(shù)研究[J]. 中草藥，2004，35（9）：1057-1059.

[9]劉慧敏，劉艷軍，黃俊軒，等. 丹參愈傷組織快速生長(zhǎng)培養(yǎng)方法[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，23（7）：14-16.

[10]毛 瑩，袁 媛，何希榮，等. 不同元素對(duì)丹參毛狀根生長(zhǎng)及丹參酮類成分積累的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（11）：6-8.

[11]梁 紅，何宇清，趙 潔. 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)丹參葉片脫分化及根芽分化的效應(yīng)[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1997，31（3）：328-331.

[12]王建英，劉 滌. 丹參的器官發(fā)生[J]. 植物生理學(xué)通訊，1987（6）：46.

[13]房師梅，雷世俊，王洪波，等. 丹參組培快繁技術(shù)研究[J]. 北方園藝，2013（21）：123-126.

[14]王維婷，單成鋼，房翠萍，等. 丹參組織培養(yǎng)及再生體系的建立與優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（4）：21-23.

[15]解曉紅，李江輝，馮文龍，等. 丹參組培快繁技術(shù)研究[J]. 中藥材，2004，27（7）：474-475.

[16]蔡朝暉，高山林，徐德然. 丹參組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1991，22（2）：65-68.

[17]晏 瓊，胡宗定，吳建勇. 生物和非生物誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響[J]. 中草藥，2006，37（2）：262-265.

[18]周 偉，姚倩雯，錢忠英，等. 丹參毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化[J]. 上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，36（2）：93-98.

[19]談榮慧，張金家，趙淑娟. 丹參毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)中藥雜志，2014，39（16）：3048-3053.文 鳳，孫 亮，劉 峰，等. 陸地棉脂肪酸去飽和酶基因GhFAD2-1的克隆與表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（12）：74-78.