早期大腸癌中DTL核蛋白表達(dá)及其意義

周瑾， 蔡紅兵， 吳秀梅

南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院護(hù)理部(廣東廣州 510315)

大腸癌(colorectal cancer)是常見的惡性腫瘤，包括結(jié)腸癌和直腸癌。其病因與遺傳、生活方式、大腸腺瘤等關(guān)系密切[1]。DTL(denticleless E3 ubiquitin protein ligase homolog )為無齒E3泛素蛋白連接酶同源物，最初在視黃酸誘導(dǎo)分化的人胚胎腫瘤細(xì)胞系NT2中被克隆[2]。DTL參與調(diào)控多種分子的泛素化降解，進(jìn)而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程、DNA損傷修復(fù)等多種生理活動[3]。在進(jìn)一步研究中，DTL在在多種腫瘤組織中特異性高表達(dá)，發(fā)揮了候選癌基因的作用，包括了肝癌、胃癌、Ewing肉瘤和乳腺癌[3-7]。與大腸組織相比，DTL基因mRNA水平在大腸癌組織中明顯升高，并能被miR-30a-5p抑制，參與大腸癌的發(fā)病過程[8-9]。然而，作為一個核表達(dá)蛋白，目前還沒有任何研究報導(dǎo)其與大腸癌臨床參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系。在本研究中，我們通過免疫組化的方法探討DTL核蛋白在大腸癌與大腸組織中的表達(dá)，并分析DTL蛋白核表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。本研究表明，DTL蛋白核表達(dá)作為不利的因素參與了大腸癌的發(fā)病過程。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于2014年2月至2017年3月收集南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院139例手術(shù)I～Ⅱ期大腸腺癌和35例存檔大腸石蠟組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料完整；(2)符合WHO中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)患者或家屬簽屬知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有腸道手術(shù)史；(2)有腸道疾病手術(shù)史；(3)大腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)；(4)術(shù)前有放化療史?；颊吣挲g19～79歲，其中男93例，女46例。

1.2 主要試劑 免疫組化采用SP法，其試劑盒購自福建邁新公司。

1.3 免疫組化 將石蠟切片置于60℃烤箱烘烤2 h后將切片按順序浸入二甲苯中各脫蠟。進(jìn)一步在不同梯度酒精中水化2 min；將切片放入盛有檸檬酸鹽抗原修復(fù)液的孵育槽中，高溫高壓修復(fù)2 min，室溫自然冷卻；進(jìn)一步按照SP試劑盒進(jìn)行免疫組化檢測：簡要地，滴加卵白素后加入d-生物素溶液，進(jìn)而內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑阻斷。在加入10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min后棄血清；滴加1∶100稀釋DTL兔抗人抗體(美國Abcam公司)，4℃孵育過夜；滴加二抗(生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG)后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min；PBS沖洗后滴加新鮮配制的DAB液于切片中顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察染色效果。

1.4 免疫組化結(jié)果判定 免疫染色評分以胞核單獨進(jìn)行。每張切片DTL表達(dá)水平采用公式：胞核評分=表達(dá)強度(0：無著色；1分：弱著色；2：著色；3：強著色)+著色細(xì)胞數(shù)(0分≤10%；1分≤50%；2≤70%；3>75%)；高表達(dá)：≥4分；低表達(dá)：<4分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。DTL蛋白在大腸癌與大腸組織以及其蛋白表達(dá)與臨床參數(shù)相關(guān)性采用2檢驗。生存預(yù)后分析采用Mann WhitneyU檢驗，Cox模型用于評估DTL表達(dá)作為影響患者生存的獨立預(yù)后因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DTL蛋白在大腸癌中核漿共表達(dá) 運用免疫組化染色檢測了139例大腸癌和35例大腸組織中DTL蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，DTL蛋白在正常大腸組織中低表達(dá)，但在大腸癌組織中，可出現(xiàn)低表達(dá)和高表達(dá)兩種不同的情況(圖1)。

A：DTL在大腸癌中高表達(dá)；B：DTL在大腸癌中低表達(dá)；C：DTL在大腸組織中低表達(dá)

圖1 DTL在大腸癌和大腸組織中表達(dá)(免疫組化，×400)

2.2 DTL在大腸癌中的表達(dá) 分析139例大腸癌組織和35例正常大腸組織之間DTL蛋白高表達(dá)比率差異。數(shù)據(jù)分析顯示，與正常大腸組織相比，DTL蛋白在大腸癌中表達(dá)明顯升高(P<0.001)。見表1。

表1 DTL蛋白在不同大腸組織中的表達(dá) 例

2.3 DTL過表達(dá)與臨床參數(shù)和預(yù)后之間相關(guān)性 雖然增加的DTL蛋白表達(dá)與大腸癌患者年齡、性別及T分期無關(guān)，見表2。但DTL蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后相關(guān)，其過表達(dá)明顯不利于大腸癌患者的預(yù)后。結(jié)果表明，DTL表達(dá)越高，患者綜合生存時間越短(P=0.014)。見圖2。

表2 大腸癌DTL表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性 例

圖2 DTL蛋白的表達(dá)與大腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 DTL蛋白水平是大腸癌患者生存的獨立預(yù)后因子 利用Cox模型評估DTL在大腸癌中作為獨立預(yù)后因子的可能性。單變量和多變量分析結(jié)果都顯示，DTL表達(dá)水平可作為判斷大腸癌患者預(yù)后的獨立性因素(P=0.019)。見表3。

表3 總生存期單變量和多變量的Cox回歸分析

3 討論

DTL基因，又名RAMP/DCAF2/L2DTL，編碼了一個推測性730氨基酸的蛋白，包含了6個高度保守的5個WD40-重復(fù)區(qū)域，能與DDB1/CULLIN4相互作用。除此之外，DTL是CRL4底物特異的適配子，介導(dǎo)多聚泛素化降解CDT1和P21等，這些機理的研究表明DTL發(fā)揮了關(guān)鍵性的生理性角色[10-12]。對于DTL在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的生理機能，前期有研究報道DTL-/-純合子小鼠胚胎在2～4周細(xì)胞死亡，且細(xì)胞核形態(tài)異常，這提示DTL對細(xì)胞增殖和生長是必需的，可能其參與染色質(zhì)復(fù)制有關(guān)[13]。DTL定位在染色體1q32。在這個區(qū)域，多個腫瘤存在著高頻率擴增[14]。越來越多的研究表明，DTL在一些腫瘤中高表達(dá)，包括了Ewing肉瘤[7]和胃癌[2]等。而在大腸癌中，也有相關(guān)的研究表明，與大腸黏膜相比，DTL mRNA在大腸癌中表達(dá)明顯升高，這提示DTL在大腸癌發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。然而，其蛋白在大腸中的表達(dá)與臨床參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系尚未見報道。

DTL是泛素連接酶CRL4的一種底物接頭蛋白。CRL4泛素連接酶是公認(rèn)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白，在有絲分裂和S期過程中具有重要作用。CRL4-DTL可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21發(fā)生泛素化降解，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的死亡[15]。在本研究中，我們首先觀察到，DTL是一個核表達(dá)為主的蛋白。與大腸組織相比，DTL蛋白在大腸癌中表達(dá)明顯上調(diào)。該結(jié)果與外國學(xué)者分別在乳腺癌[6]、Ewing肉瘤[7]和胃癌[2]等腫瘤結(jié)果相似，同時也驗證了Baraniskin等[8]報道DTL mRNA水平在大腸癌中表達(dá)升高的可靠性。為了明確DTL蛋白表達(dá)與大腸癌臨床進(jìn)展之間的關(guān)系，我們統(tǒng)計分析了DTL蛋白表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，雖然增高的DTL表達(dá)與大腸癌的發(fā)病年齡、性別及T分期無關(guān)，該結(jié)果類似于Baraniskin等[8]的研究，提示DTL高表達(dá)與大腸癌的增殖關(guān)系不是很明確。

在以往的研究[3-4，6-7]中，DTL高表達(dá)作為不利的預(yù)后因子參與了多種腫瘤的發(fā)病過程。我們分析了DTL蛋白在大腸癌中的高表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，DTL的表達(dá)與大腸癌的預(yù)后呈明顯負(fù)相關(guān)。DTL蛋白表達(dá)越高，大腸癌患者綜合生存時間越短，反之，DTL表達(dá)越低，患者綜合生存時間越長。該數(shù)據(jù)與其在胃癌[2]和Ewing肉瘤[7]相一致，提示DTL高表達(dá)是大腸癌預(yù)后不良的重要因素。最后，我們單變量和多變量分析發(fā)現(xiàn)，DTL表達(dá)可以作為評估大腸癌預(yù)后的一個獨立影響因子。

總之，我們研究發(fā)現(xiàn)DTL蛋白在大腸癌中表達(dá)上調(diào)，其促進(jìn)了大腸癌臨床進(jìn)展，并可作為大腸癌一個獨立不良預(yù)后因子。結(jié)果提示DTL是大腸癌預(yù)后判斷的一個重要分子標(biāo)志，其亦可能作為大腸癌分子治療靶標(biāo)。本研究結(jié)果為后續(xù)相關(guān)研究提供了一定的前期基礎(chǔ)和理論支持。