TSP50在肺腺癌中的表達(dá)及意義

胡幸， 鄧星輝， 何凱寧

1江門市五邑中醫(yī)院病理科(廣東江門 529000)； 2江門市中心醫(yī)院病理科(廣東江門 529000)

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在我國(guó)其發(fā)病率和病死率均位于各種腫瘤的首位[1]。肺癌約85%是非小細(xì)胞性肺癌，其中肺腺癌是最常見的組織學(xué)類型。盡管近年來(lái)關(guān)于肺腺癌的手術(shù)治療、藥物靶向治療及放療均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但肺腺癌患者的總體生存率仍處于較低的水平[2]。探索新的肺腺癌惡性行為相關(guān)分子靶點(diǎn)及其內(nèi)在機(jī)制，可望為隨后的靶向治療提供理論支持。睪丸特異性蛋白酶50(testes-specific protease 50，TSP50)，是一種新發(fā)現(xiàn)的癌/睪丸抗原(cancer/testis antigen，CTA)，CTA是一類僅在正常睪丸生殖細(xì)胞中及多種腫瘤中異常表達(dá)的抗原，在腫瘤早期診斷及靶向治療方面有著巨大的潛力[3-4]。TSP50己發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中高表達(dá)，并參與這些腫瘤的惡性進(jìn)展，與多種腫瘤的臨床病理特征及預(yù)后存在著密切關(guān)系[3， 5-6]。目前關(guān)于TSP50在肺腺癌的表達(dá)及臨床意義的研究較少，英文文獻(xiàn)僅有2篇分別報(bào)道了TSP50在非小細(xì)胞性肺癌惡性生物學(xué)行為中的作用及臨床意義[7-8]，而中文文獻(xiàn)尚未見TSP50表達(dá)與肺癌關(guān)系的研究。而且，以往的研究并未對(duì)TSP50表達(dá)與肺腺癌或肺鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系進(jìn)行獨(dú)立的分析。鑒于肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌在細(xì)胞起源、基因組學(xué)改變、預(yù)后等方面的差異[9]，因此，單獨(dú)對(duì)TSP50在肺腺癌的表達(dá)，及其與各項(xiàng)臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析有助于我們更深入地了解TSP50在肺腺癌中的生物學(xué)功能和臨床意義。本研究主要通過免疫組化學(xué)方法探討TSP50在肺腺癌的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系，從而為尋找肺腺癌早期診斷以及靶向治療提供新的候選標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月至2018年1月就診于五邑中醫(yī)院并行肺癌根治性手術(shù)治療的肺腺癌病例72例，其中男42例，女30例，中位年齡59歲。所有患者均為初治病例，手術(shù)前未接受過化療或放療，術(shù)后均經(jīng)病理確診為肺腺癌，我們對(duì)所有肺腺癌切片進(jìn)行了鏡下復(fù)查，根據(jù)2015最新WHO肺腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了亞型分類。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及判讀 石蠟包埋的肺腺癌及癌旁組織切片4 μm，烤箱預(yù)烤片2 h，隨后應(yīng)用Envision二步法完成免疫組織化學(xué)染色：切片置于二甲苯脫蠟2次；切片逐級(jí)乙醇脫水；加3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶；檸檬酸鹽緩沖液高壓加熱修復(fù)抗原；加一抗(TSP50，1∶200，Proteintech公司)，濕盒內(nèi)4℃孵育過夜；加生物素化二抗，37℃孵育30 min；DAB顯色及復(fù)染、透明、中性樹膠封片。

免疫組織化學(xué)結(jié)果采用半定量方法，即：按著色強(qiáng)度分為0(不著色)，1(淺著色)，2(中度著色)，3(強(qiáng)染色)；按陽(yáng)性染色細(xì)胞比例分為0(<5%細(xì)胞著色)，1(5%～25%細(xì)胞著色)，2(26%～50%細(xì)胞著色)，3(5%～100%)。以染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分乘積作為最終分值。綜合評(píng)分≤4為低表達(dá)，>4為高表達(dá)。以上評(píng)分由兩位高年資病理醫(yī)師獨(dú)立閱片評(píng)分，如遇獨(dú)立評(píng)分不一致則經(jīng)共同復(fù)核確定最終評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，肺腺癌及配對(duì)癌旁組織之間的TSP50蛋白表達(dá)差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，TSP50蛋白表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性采用2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSP50在肺腺癌及癌旁組織的表達(dá)情況 對(duì)72例肺腺癌及配對(duì)的癌旁組織進(jìn)行TSP50抗體染色，結(jié)果顯示TSP50蛋白主要在細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，未見細(xì)胞膜或細(xì)胞核著色。在72例肺腺癌組織中，高表達(dá)53例(73.6%，53/72)，而配對(duì)癌旁組織，高表達(dá)僅11例(15.3%，11/72)。兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

A：肺腺癌HE切片(×100)；B：TSP50在肺腺癌組織中高表達(dá)(×100)；C：TSP50在肺腺癌組織中高表達(dá)(×400)；D：癌旁肺組織HE切片(×100)；E：TSP50在癌旁肺組織中低表達(dá)(×100)；F：TSP50在癌旁肺組織中低表達(dá)(×400)

圖1 TSP50在肺腺癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況

2.2 TSP50表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)TSP50在肺腺癌組織中的免疫組化染色強(qiáng)度將肺腺癌分為高表達(dá)組(n=53)與低表達(dá)組(n=19)，分析TSP50蛋白表達(dá)肺腺癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSP50表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P=0.009，P=0.022)，而與患者性別、年齡、是否吸煙、腫物大小及組織學(xué)類型無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

3 討論

肺腺癌是常見的肺癌組織學(xué)類型，隨著針對(duì)上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)等靶基因的分子靶向治療的進(jìn)展[10-12]，肺腺癌的預(yù)后水平己得到了明顯的改善，但仍有相當(dāng)大部分的肺腺癌缺乏特異的基因靶標(biāo)，無(wú)特異的靶向藥物可用，預(yù)后較差[13]。因此，發(fā)現(xiàn)和探索更多肺腺癌的特異性基因靶點(diǎn)，對(duì)于進(jìn)一步開展針對(duì)性的分子靶向治療有著非常重要的意義。TSP50作為一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原，己被證實(shí)在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，是一個(gè)潛在的分子靶點(diǎn)[3， 5， 14]。但TSP50在肺腺癌中研究尚少，目前中文文獻(xiàn)尚未有TSP50與肺腺癌關(guān)系的研究報(bào)道，英文文獻(xiàn)中也僅個(gè)別研究報(bào)道了TSP50在非小細(xì)胞性肺癌的表達(dá)及功能，具體到TSP50與肺腺癌的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究對(duì)TSP50在肺腺癌中表達(dá)水平，其與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。

TSP50最早由Yuan等[15]從睪丸組織和乳腺癌組織中分離出的低甲基化片段， 其基因位于人染色體3p14～p12，含有4個(gè)外顯子，全長(zhǎng)1 155 bp。Xu等[16]的研究顯示TSP50在脾臟、腎臟、肝臟、肺、心臟等正常組織均不表達(dá)或表達(dá)量非常低，但是高表達(dá)在人正常睪丸組織和乳腺癌中，提示TSP50是一種腫瘤相關(guān)抗原，可能是乳腺癌等腫瘤的一個(gè)特征標(biāo)記物。隨后多項(xiàng)研究也證實(shí)TSP50在結(jié)直腸癌、胃癌、喉癌中均高表達(dá)[5，14， 17]，本研究與文獻(xiàn)一致，發(fā)現(xiàn)TSP50在肺腺癌的表達(dá)明顯高于癌旁非腫瘤組織(P<0.001)。這些結(jié)果表明TSP50在多種腫瘤高表達(dá)可能是一個(gè)普遍事件，進(jìn)一步表明TSP50作為一種癌/腫瘤抗原的特異性及其應(yīng)用潛力。

表1 TSP50表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

我們的研究還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)TSP50與肺腺癌存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及更晚期的TNM分期密切相關(guān)，而與性別、年齡、吸咽、腫瘤大小與組織學(xué)類型無(wú)明顯相關(guān)性。在胃癌中，TSP50表達(dá)與年輕患者、較晚TNM分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例呈明顯正相關(guān)，且高表達(dá)TSP50組中位生存年齡明顯低于低表達(dá)TSP50組[5，18]。在結(jié)腸癌組織中，TSP50的表達(dá)也明顯升高，且多因素Cox回歸模型顯示TSP50是結(jié)腸癌患者的一個(gè)獨(dú)立的不良預(yù)后因子[14]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步提示TSP50作為候選標(biāo)志物在腫瘤診斷、評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后判斷等方面可能有著重要的作用。在肺癌中，Qiao等[8]近期的報(bào)道也表明TSP50在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，并且TSP50與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及腫瘤分化程度密切相關(guān)，TSP50高表達(dá)可能是非小細(xì)胞肺癌的一項(xiàng)獨(dú)立不良預(yù)后因素，這些結(jié)果與我們的研究一致。但是該研究沒有分別對(duì)TSP50在肺腺癌及肺鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)進(jìn)行獨(dú)立的分析，肺腺癌與鱗狀細(xì)胞癌的組織起源及分子事件均不同，TSP50的表達(dá)及作用可能也存在差異。因此，我們的工作集中于研究TSP50在肺腺癌的表達(dá)及臨床意義，有助于進(jìn)一步探索TSP50在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。本研究的局限性也主要體現(xiàn)在：(1)僅對(duì)TSP50在肺腺癌的表達(dá)及臨床意義進(jìn)行了研究，我們希望在以后的工作中對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌中TSP50的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，并比較TSP50在兩者的表達(dá)和臨床意義是否存在差異；(2)肺腺癌的病例數(shù)量尚有限，且是單中心病例，在后續(xù)的工作中希望能擴(kuò)大樣本量，并納入多中心病例，以期得到更為準(zhǔn)確可靠的結(jié)果；(3)缺乏與TSP50表達(dá)相對(duì)應(yīng)的患者預(yù)后信息，雖然我們通過在線生存分析網(wǎng)站Kaplan-Meier Plotter (www.kmplot.com)分析發(fā)現(xiàn)，在886例肺腺癌中，TSP50高表達(dá)的患者生存時(shí)間顯著短于TSP50低表達(dá)的患者，這與本研究的結(jié)果是相吻合的，但是，如果能在同一批病例中進(jìn)行表達(dá)量與預(yù)后的相關(guān)分析，結(jié)果可信度會(huì)更高，我們后續(xù)的工作將會(huì)完善相關(guān)的預(yù)后資料。

多項(xiàng)研究在細(xì)胞及動(dòng)物水平均證實(shí)TSP50可促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。在胃癌細(xì)胞中，抑制TSP50表達(dá)可明顯減弱癌細(xì)胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，而上調(diào)TSP50表達(dá)可增強(qiáng)這些作用[5]。在乳腺癌中，TSP50 能夠通過 NF-κB依賴的方式上調(diào) MMP-9的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力。在喉癌細(xì)胞中，下調(diào)TSP50表達(dá)，可抑制增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[19]。而在肺癌中，TSP50的作用也少有報(bào)道，Qiao等[7]在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株95D中研究發(fā)現(xiàn)，抑制TSP50表達(dá)可通過阻滯細(xì)胞周期從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。盡管如此，TSP50在肺癌中作用和機(jī)制還需要在更多體外細(xì)胞株及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TSP50在肺腺癌中高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究TSP50在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并可能為肺癌靶向治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。