血清抗子宮內(nèi)膜抗體、HMGB1與視黃醇結(jié)合蛋白4在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義*

張洪江， 金春花， 姜春善， 曾婕， 王雅巖

延邊大學(xué)附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2婦科， 3呼吸內(nèi)科(吉林延吉 133000)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的婦科疾病，常發(fā)病的人群是育齡婦女，主要特點(diǎn)是患者的內(nèi)膜出現(xiàn)異常生長(zhǎng)，給患者帶來(lái)較大的危害，近年來(lái)患子宮內(nèi)膜異位癥的人數(shù)在逐年上升[1]?？棺訉m內(nèi)膜抗體(anti-endometrial antibody，EMAb)是一種生物抗體，主要是以子宮內(nèi)膜為靶原，其主要特點(diǎn)是存在技術(shù)依賴性，通過(guò)卵巢激素的調(diào)節(jié)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜自身抗體EMAb的產(chǎn)生[2]。血清高遷移率組蛋白B1(high mobility histone B1，HMGB1)屬于一種晚期炎性介質(zhì)，視黃醇結(jié)合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)與炎性標(biāo)記物有緊密的聯(lián)系，在子宮內(nèi)膜異位癥中具有重要的參與作用[3-4]。但是相關(guān)的研究數(shù)據(jù)較少。本文主要研究血清EMAb、HMGB1與RBP4在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年1月于我院確診患有子宮內(nèi)膜異位癥的女性患者55例作為子宮內(nèi)膜異位癥組，年齡40～70歲，平均(56.3±5.8)歲。所有患者均符合美國(guó)生育協(xié)會(huì)的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期12例，Ⅱ期14例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例。選取同期于我院進(jìn)行健康體檢的女性健康志愿者55例作為對(duì)照組，年齡40～70歲，平均(55.6±5.9)歲。兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有研究對(duì)象均為育齡期婦女；均未發(fā)現(xiàn)婦科腫瘤以及急性炎癥；所有研究對(duì)象月經(jīng)周期規(guī)律，在3個(gè)月之前停止服用激素類的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有心腦血管疾病患者；具有精神疾病患者；哺乳及妊娠期婦女；具有肝、腎等系統(tǒng)性嚴(yán)重的疾病。本研究所有研究對(duì)象及家屬均知情，簽署家屬知情通知書，并獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

主要試劑：兔抗鼠EMAb(由Hyclone公司提供)，兔抗人HMGB1、RBP4抗體(由Invitrogen公司提供)，PBS緩沖液和SDS-PAGE凝膠(BD公司提供)；ELISA試劑盒(Dako公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 分別采集兩組研究對(duì)象的清晨空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血5 mL，置入抗凝試管中，使用離心機(jī)以3 000 r/min的速度進(jìn)行血清分離，20 min后提取樣本血清至試管，然后放入-70℃的冰箱冷藏待測(cè)。

1.2.2 雙抗體夾心法檢測(cè)血清EMAb表達(dá) 將待測(cè)血清吸附在微量滴定板上的小孔里，進(jìn)行洗滌1次；加入待測(cè)的抗原，如果兩種抗原產(chǎn)生特異反應(yīng)，就會(huì)產(chǎn)生結(jié)合，要把剩余的抗體清洗干凈；之后要加入酶聯(lián)抗體和待測(cè)的抗原之間產(chǎn)生特異反應(yīng)，形成“夾心”現(xiàn)象；最后加入酶底物，如果產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物，就說(shuō)明待測(cè)血清有對(duì)應(yīng)的抗原，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行，分析血清EMAb表達(dá)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)HMGB1、RBP4蛋白表達(dá) 將采集的標(biāo)本，使用PBS緩沖液對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行清洗，使用裂解液裂解之后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，加入蛋白緩沖液之后進(jìn)行電泳，之后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶之中，之后使其與一抗相結(jié)合，在5℃的環(huán)境下進(jìn)行孵育。次日，使用TBST緩沖液進(jìn)行清洗，在37℃的環(huán)境下使其與二抗相結(jié)合，1 h后使用TBST緩沖液進(jìn)行清洗，然后使用顯影劑使其顯色，操作步驟嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，對(duì)HMGB1、RBP4蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 兩組間EMAb、HMGB1、RBP4陽(yáng)性表達(dá)比較 子宮內(nèi)膜異位癥組EMAb、HMGB1、RBP4水平顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組間EMAb、HMGB1、RBP4陽(yáng)性表達(dá)比較 例(%)

2.2 EMAb、HMGB1、RBP4與子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床病理資料的關(guān)系 子宮內(nèi)膜異位癥患者EMAb、HMGB1、RBP4陽(yáng)性表達(dá)與年齡、體質(zhì)指數(shù)無(wú)關(guān)(P>0.05)。子宮內(nèi)膜異位癥患者EMAb、HMGB1、RBP4陽(yáng)性表達(dá)與分期、異位囊腫直徑大小、分化程度有關(guān)，Ⅲ+Ⅳ期、異位囊腫直徑大小≥5 cm、高分化EMAb、HMGB1、RBP4陽(yáng)性表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3種因子與子宮內(nèi)膜異位癥患者臨床病理資料比較 例(%)

2.3 EMAb、HMGB1與RBP4的相關(guān)性 EMAb、HMGB1與RBP4在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)呈正相關(guān)。見表3。

表3 EMAb、HMGB1與RBP4的相關(guān)性

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥在婦科疾病中較為常見，其發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)良好，但是也具有種植、侵襲、復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，和惡性腫瘤相似，給患者的身心健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅[5]?；颊咴谂R床上的主要表現(xiàn)是痛經(jīng)、性交痛、盆腔痛，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成不孕。一些患者的臨床特征不具有典型性，同時(shí)缺少特異性，因此對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的早期診斷，較困難[6]。子宮內(nèi)膜異位癥做到早期診斷和治療，有助于患者痛苦的減輕，促進(jìn)生活質(zhì)量的提高。

目前，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制沒(méi)有明確指出，研究顯示，其發(fā)病主要和種植、淋巴及靜脈散播、內(nèi)分泌、遺傳性、免疫機(jī)制有關(guān)[7]。種植：經(jīng)血逆流種植是指在經(jīng)期，子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞隨血液出現(xiàn)逆流現(xiàn)象，通過(guò)盆腔后在卵巢和鄰近的盆腔腹膜間種植，并且持續(xù)生長(zhǎng)并且蔓延，產(chǎn)生盆腔內(nèi)異癥[8]。研究顯示[9]，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的決定性因素是在位內(nèi)膜出現(xiàn)差異，其決定逆流經(jīng)血內(nèi)膜碎片是否可以異地黏附和生長(zhǎng)。淋巴及靜脈散播：在遠(yuǎn)離盆腔的部位發(fā)生子宮內(nèi)膜異位癥，主要是由淋巴及靜脈散播造成，子宮內(nèi)膜組織經(jīng)過(guò)靜脈以及淋巴管向遠(yuǎn)處發(fā)生轉(zhuǎn)移，且同感光學(xué)鏡的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在盆腔靜脈、淋巴管以及淋巴結(jié)中，有子宮內(nèi)膜組織[10]。內(nèi)分泌：子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病與異位組織中激素受體水平表達(dá)有關(guān)，子宮內(nèi)膜異位癥患者月經(jīng)紊亂是因?yàn)楫愇粌?nèi)膜與在位內(nèi)膜的發(fā)育不一致[11]。遺傳學(xué)：基因數(shù)據(jù)顯示[12]，在1號(hào)和7號(hào)染色體上，基因發(fā)生變異，和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病有緊密聯(lián)系。免疫機(jī)制：子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病與免疫機(jī)制有關(guān)，在子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹腔液細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)異常，活性也發(fā)生改變，患者血清中IgG、EMAb水平增加[13]。

EMAb主要依靠子宮內(nèi)膜為靶原，屬于一種生物抗體，其特點(diǎn)是具有激素依賴性，經(jīng)過(guò)卵巢激素的調(diào)節(jié)作用，盆腔中會(huì)出現(xiàn)異位內(nèi)膜種植灶，通過(guò)巨噬細(xì)胞吞噬，子宮內(nèi)膜中特定抗原會(huì)發(fā)生識(shí)別，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，子宮內(nèi)膜自身抗體EMAb會(huì)產(chǎn)生[14]。滕輝等[15]指出，子宮內(nèi)膜異位癥是否發(fā)病與血清中EMAb水平的高低有關(guān)。EMAb也與不孕癥有關(guān)。本研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥EMAb、HMGB1與RBP4陽(yáng)性表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著子宮內(nèi)膜異位癥分期的增加，EMAb陽(yáng)性表達(dá)也逐漸升高。說(shuō)明血清EMAb、HMGB1與RBP4和子宮內(nèi)膜異位癥的診斷具有一定聯(lián)系。HMGB1屬于非組蛋白核蛋白，在各種組織中大量存在，HMGB1參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化和遷移[16]。子宮內(nèi)膜異癥的發(fā)生與發(fā)展，HMGB1起到了關(guān)鍵性的作用。子宮內(nèi)膜異癥患者的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)失控，促進(jìn)HMGB1的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，通過(guò)多種信號(hào)作用對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行放大，最后造成子宮內(nèi)膜異癥向分級(jí)方向發(fā)展。HMGB1可以激活相關(guān)的基因，減少異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡，形成子宮內(nèi)膜異位病灶[17]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者HMGB1陽(yáng)性表達(dá)較高，Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥高于Ⅰ期，說(shuō)明子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生與HMGB1有關(guān)，與其病情的嚴(yán)重程度相關(guān)。EMAb、HMGB1與RBP4陽(yáng)性表達(dá)與異位囊腫直徑大小、分化程度有關(guān)。RBP4屬于一種球蛋白，與炎癥反應(yīng)相關(guān)，結(jié)合其受體導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。RBP4誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生主要是通過(guò)促進(jìn)促炎分子的表達(dá)，RBP4參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展的途徑是通過(guò)促進(jìn)促炎分子和黏附分子的表達(dá)，發(fā)揮著重要作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中RBP4表達(dá)水平較高，Ⅳ期子宮內(nèi)膜異位癥高于Ⅰ期。結(jié)果與魏麗[20]保持一致。本研究結(jié)果顯示，EMAb、HMGB1與RBP4之間呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明EMAb、HMGB1、RBP4三種因子在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中具有一定的協(xié)同作用?？赡軝C(jī)制：HMGB1與RBP4結(jié)合，有助于MAPK信號(hào)通路激活，從而誘導(dǎo)大量炎癥因子表達(dá)，相互作用之后，促進(jìn)NF-κB激活，調(diào)控多種基因，NF-κB會(huì)增強(qiáng)黏附分子表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性以及黏附作用，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。在檢測(cè)效能研究中，EMAb、HMGB1、RBP4三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)在不同分期中的診斷準(zhǔn)確度要高于單項(xiàng)標(biāo)志物檢測(cè)，說(shuō)明在通過(guò)標(biāo)志物對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥進(jìn)行診斷時(shí)，聯(lián)合檢測(cè)的效果要更突出。這一研究結(jié)論仍需要大量的研究樣本，來(lái)確定其可靠性。

綜上所述，血清EMAb、HMGB1與RBP4在子宮內(nèi)膜異位癥患者中均呈現(xiàn)較高表達(dá)，三者聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能優(yōu)于單獨(dú)檢測(cè)，為子宮內(nèi)膜異位癥的臨床檢測(cè)提供了一定的理論依據(jù)。