手足口病患兒25-羥維生素D3與外周血Th17/Treg及相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系*

何媛， 何巍巍， 周小娟， 梁曉君， 王文娟， 江永清△， 盧軍

九江學(xué)院附屬醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2皮膚科(江西九江 332000)

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一種主要發(fā)生于5歲內(nèi)的嬰幼兒病毒傳染性疾病，主要由柯薩奇病毒A16型(CV-A16)和腸道病毒71 型(EV-A71) 引起。但近年來，HFMD的病原譜已發(fā)生變化，非EV-A71和非CV-A16的其他腸道病毒成為優(yōu)勢(shì)病原體[1]。HFMD主要的臨床表現(xiàn)是發(fā)熱，手、腳、臀部水皰疹，口腔黏膜潰瘍，具有自愈性，但一些患兒可發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹和神經(jīng)呼吸綜合征[2]。HFMD的發(fā)生機(jī)制尚不十分明確。近年來研究表明，患兒免疫調(diào)節(jié)功能異常， Th17/Treg 細(xì)胞比例失衡對(duì)HFMD的發(fā)生具有重要作用[3-5]。關(guān)于維生素D(VitD)，除了維持機(jī)體鈣、磷水平穩(wěn)定外，可與免疫細(xì)胞上特定維生素D受體(VDR)結(jié)合[6]后作用于淋巴細(xì)胞，尤其是通過抑制T淋巴細(xì)胞增殖和分化來調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)。那么，VitD對(duì)HFMD患兒中Th17/Treg 細(xì)胞失衡是否有影響，相關(guān)報(bào)道甚少。本課題就HFMD患兒不同血清VitD水平與外周血Th17/Treg 細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)系，進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選自2016年1月至2018年10月九江學(xué)院附屬醫(yī)院收治的142例HFMD患兒。男73例，女69例，年齡(30.2±7.5)個(gè)月，均符合國家衛(wèi)生健康委員會(huì)制定的《手足口病診療指南 (2018年版)》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均無神經(jīng)、免疫等系統(tǒng)基礎(chǔ)疾病史。按照建議[8]標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)HFMD患兒血清 25(OH)D3水平，分為25(OH)D3正常組(>50 nmol/L)45例、25(OH)D3不足組(37.5～50 nmol/L)56例、25(OH)D3缺乏組(<37.5 nmol/L)41例。各組兒童的性別和年齡等一般臨床資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同25(OH)D3水平各組患者一般資料比較

1.2 儀器 Cobas 601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀(羅氏公司)；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；ST-360洗板機(jī)和酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有患兒清晨空腹，抽靜脈血3 mL，血液凝固后，在抽血當(dāng)天于3 000 r/min離心3 min，測(cè)定25(OH)D3水平，取出一部分血清-80℃保存，用于檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)；另取EDTA-K2抗凝靜脈血2 mL，檢測(cè)輔助性T細(xì)胞17(Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。

1.3.2 檢測(cè)方法 (1)25(OH)D3檢測(cè):采用羅氏Cobas 601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑，嚴(yán)格按照儀器和試劑操作說明書進(jìn)行操作，并記錄結(jié)果。(2)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞檢測(cè):采用BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀和美國庫爾特公司提供的試劑，嚴(yán)格按照儀器和試劑操作說明書進(jìn)行操作。并采用BD Cell Quest軟件分析測(cè)定Th17/Treg的比值。(3)IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)，試劑購自上海江萊生物科技有限公司，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均表示；對(duì)不符合正態(tài)分布的指標(biāo)，經(jīng)lg對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后，多組間比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用Bonferroni法，相關(guān)系數(shù)采用Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同25(OH)D3水平中，各組Th17、Treg占CD4+T細(xì)胞比例結(jié)果比較 與25(OH)D3正常組相比，25(OH)D3不足組和缺乏組的HFMD患兒Th17占CD4+T細(xì)胞比例、Th17/Treg比值升高，而Treg占CD4+T細(xì)胞比例則下降(均P<0.05)；25(OH)D3不足組和缺乏組相比，缺乏組Th17占CD4+T細(xì)胞比例、Th17/Treg比值更大，Treg占CD4+T細(xì)胞百分比更小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.05)。見表2。

項(xiàng)目例數(shù)Th17(%)Treg(%)Th17/Treg25(OH)D3正常組452.33±0.436.49±1.650.31±0.1025(OH)D3不足組564.18±1.28*5.82±2.01*0.74±0.17*25(OH)D3缺乏組419.54±1.46*△2.21±1.84*△2.34±0.31*△F值4.7826.0319.737P值0.0300.0150.001

*與25(OH)D3正常組比較P<0.05；△與25(OH)D3不足組比較P<0.05

2.2 不同25(OH)D3水平各組細(xì)胞因子水平比較 3組細(xì)胞因子水平相比較，血清IL-17、IL-6水平結(jié)果為: 25(OH)D3正常組<25(OH)D3不足組<25(OH)D3缺乏組；IL-10、TGF-β水平結(jié)果為：25(OH)D3正常組>25(OH)D3不足組>25(OH)D3缺乏組。各組間兩兩相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

項(xiàng)目例數(shù)IL-17/(ng/L)IL-6/(ng/L)IL-10/(ng/L)TGF-β/ (μg/L)25(OH)D3正常組451.35±0.281.58±0.162.99±0.092.74±0.2625(OH)D3不足組561.96±0.43*2.28±0.24*1.47±0.19*1.60±0.13*25(OH)D3缺乏組413.11±0.34*△3.43±0.39*△0.63±0.28*△0.78±0.41*△F值15.11511.23112.54810.083P值0.0000.0000.0000.000

*與25(OH)D3正常組比較P<0.05；△與25(OH)D3不足組比較P<0.05

2.3 各指標(biāo)與25(OH)D3相關(guān)性分析 Th17、IL-17、Th17/Treg、IL-6與25(OH)D3均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.465、-0.531、-0.476、-0.649，均P<0.05)，Treg、IL-10、TGF-β與25(OH)D3均呈正相關(guān)(r=0.379、0.501、0.449，均P<0.05)。

3 討論

HFMD是一種常見的小兒傳染性疾病，江西省2008年將其列為法定報(bào)告管理傳染病，之后年報(bào)告發(fā)病人數(shù)始終居所有法定傳染病的前列，以5歲以下為主，其中3歲及以下居多[1]。兒童HFMD的發(fā)病率和病情輕重程度與年齡呈負(fù)相關(guān)，主要原因?yàn)闄C(jī)體免疫力隨著年齡增長而增強(qiáng)[9]。

Th17屬于CD4+輔助型T細(xì)胞亞型，主要分泌IL-17、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子，與炎癥感染和自身免疫性疾病發(fā)生有關(guān)[10]。Treg細(xì)胞是一種T細(xì)胞亞群，具有免疫耐受作用[11]，也可通過分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用[12]，從而避免因?yàn)槊庖哐装Y反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體損傷。正常情況下，機(jī)體處于免疫穩(wěn)態(tài)可由Th17和Treg兩者相互拮抗，維持動(dòng)態(tài)平衡來實(shí)現(xiàn)。關(guān)于HFMD的發(fā)病機(jī)制，有更多研究表明HFMD患兒體內(nèi)免疫功能調(diào)節(jié)障礙，在HFMD中高表達(dá)Th17細(xì)胞，相應(yīng)Th17/Treg比值升高，IL-17A水平也顯著升高，存在Th17/Treg細(xì)胞失衡[4-5]。還有研究表明HFMD患兒外周血Th17、IL-17水平隨病情嚴(yán)重而高,而CD4+CD25+Treg細(xì)胞、IL-10、TGF-β水平隨病情嚴(yán)重而降低[3]。Li等[13]發(fā)現(xiàn)和健康對(duì)照組相比，HFMD患兒IL-6水平顯著升高，并且IL-6和疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)。

VitD屬于脂溶性維生素，無生物活性，可通過皮膚合成維生素D3(VitD3)。在肝內(nèi)，VitD3被25-羥化酶轉(zhuǎn)變成25(OH)D3，后者在1α羥化酶作用下生成1，25-二羥維生素D3[1，25-dihydroergotamine D3；1,25(OH)2D3][14]。因1,25(OH)2D3可與VDR結(jié)合發(fā)揮免疫效應(yīng)作用，從而使VitD和許多自身免疫性、感染性疾病相關(guān)，故是VitD的生物活性功能形式。但血清25(OH)D3因其生物活性穩(wěn)定，可更好地反映機(jī)體免疫狀態(tài)，是代表體內(nèi)活性VitD水平的最佳檢測(cè)指標(biāo)[15]，廣泛用于臨床檢測(cè)。

VitD通過活性形式1,25(OH)2D3與VDR發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后，可使T淋巴細(xì)胞的增殖和分化功能受到抑制，進(jìn)而抑制Th17細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IL-17[16]。有報(bào)道說VitD的免疫抑制功能可能是通過下調(diào)幼稚細(xì)胞和人類記憶CD4+T細(xì)胞的IL-17A、IL-6 和IL-22表達(dá)而發(fā)生[17]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)不同25(OH)D3水平的HFMD患兒中，與25(OH)D3正常組相比，不足組和缺乏組HFMD患兒Th17百分比、Th17/Treg比值、IL-17、IL-6水平升高(P<0.05)。25(OH)D3水平缺乏組該4個(gè)觀察指標(biāo)則比不足組要高(P<0.05)。進(jìn)一步相關(guān)性研究表明，25(OH)D3與Th17、IL-17、IL-6呈負(fù)相關(guān)，故在HFMD患兒中，25(OH)D3不足可促進(jìn)Th17和其相關(guān)炎癥因子IL-17、IL-6表達(dá)，當(dāng)過度表達(dá)后，機(jī)體炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，出現(xiàn)病理損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著25(OH)D3含量上升，Treg百分?jǐn)?shù)值、IL-10、TGF-β水平變化具體為：25(OH)D3缺乏組<25(OH)D3不足組<25(OH)D3正常組(P<0.05)。亦有很多研究表明，VitD對(duì)Treg具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能為直接促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，另外通過對(duì)T細(xì)胞的刺激作用使其表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4 (CTLA-4)和特定轉(zhuǎn)錄因子叉頭P3(FOXP3)，進(jìn)而誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生[18]。此外，VitD通過其活性形式刺激Treg細(xì)胞產(chǎn)生，抑制Th17細(xì)胞分化從而顯著促進(jìn)IL-10產(chǎn)生[19]。TGF-β由Treg細(xì)胞產(chǎn)生，可通過趨化募集單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，拮抗炎癥和抑制免疫功能[20]。本研究中，當(dāng)HFMD患兒體內(nèi)25(OH)D3含量不足時(shí)，Treg細(xì)胞產(chǎn)生減少，其相關(guān)細(xì)胞因子IL-10、TGF-β水平也下降；另外，還發(fā)現(xiàn)25(OH)D3與Treg、IL-10、TGF-β具有相關(guān)性，均為正相關(guān)，這與孔繁勇等[21]的研究相符。推測(cè)VitD可因?yàn)橛绊慣reg產(chǎn)生，進(jìn)而影響Treg相關(guān)抗炎因子IL-10、TGF-β產(chǎn)生，在HFMD中起到免疫調(diào)節(jié)作用。

總之，25(OH)D3水平可能影響HFMD患兒的Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子(IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β)的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)HFMD患兒外周血Th17/Treg免疫平衡系統(tǒng)，影響HFMD的發(fā)生。關(guān)于VitD是否會(huì)影響Th17和Treg其他相關(guān)細(xì)胞因子，這有待我們后期擴(kuò)大樣本量進(jìn)行更深入研究，從而進(jìn)一步探明HFMD的發(fā)病機(jī)制。