2008-2018年北京市傷寒、副傷寒沙門菌病原學特征

曲梅 黃瑛 張新 呂冰 賈蕾 田祎 王全意

傷寒、副傷寒是由傷寒和副傷寒(甲、乙、丙血清型)沙門菌引起，經(jīng)糞口途徑傳播，常引起急性腸道傳染病的暴發(fā)，屬于乙類傳染病，一直是北京市重點監(jiān)控的傳染病之一。隨著衛(wèi)生環(huán)境的改善及綜合防治措施的落實，北京市傷寒、副傷寒的發(fā)病得到有效控制，維持在較低水平，但仍有散發(fā)病例持續(xù)存在[1,2]。近年來，在抗生素的選擇壓力下，沙門菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴重[3]。為更好地開展監(jiān)測和防控工作，了解傷寒、副傷寒菌型變遷和流行特征，現(xiàn)將北京市2008-2018年傷寒、副傷寒沙門菌臨床分離株進行血清型、耐藥性和分子分型分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 2008-2018年，北京市腸道門診監(jiān)測系統(tǒng)采集的腹瀉患者標本，經(jīng)各區(qū)疾控中心進行分離培養(yǎng)，初步鑒定為傷寒、副傷寒沙門菌的散發(fā)臨床分離株56株，及一起輸入性傷寒暴發(fā)疫情的9株菌，共計65株。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定： 傷寒、副傷寒沙門菌的分離培養(yǎng)參照衛(wèi)生部行業(yè)標準WS280-2008附錄A進行。將各區(qū)上送的可疑傷寒、副傷寒沙門菌轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，采用法國梅里埃公司VITEK2-Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行系統(tǒng)生化鑒定。

1.2.2血清分型試驗： 針對沙門菌群(A～F)多價血清、菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和Vi抗原進行血清凝集試驗。方法為挑取三糖斜面上少量菌苔與A～F多價抗血清在室溫下進行玻片凝集，1 min 內(nèi)出現(xiàn)凝集顆粒為陽性；按同樣方法與O單價抗血清進行逐一凝集來確定O抗原，根據(jù)確定的O抗原進行相應的H多價和單價血清凝集以確定最終血清型。玻片凝集時需設生理鹽水對照。沙門菌診斷血清為丹麥SSI血清研究所產(chǎn)品，均在有效期內(nèi)使用。

1.2.3藥敏試驗： 采用最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration，MIC)法，使用上海星佰生物技術有限公司生產(chǎn)的革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板，藥物應用環(huán)丙沙星(CIP)、鏈霉素(STR)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(CHL)、磺胺異噁唑(SUL)、復方新諾明(SXT)、萘啶酸(NAL)、阿莫西林-克拉維酸(AUG)、頭孢曲松(CRO)、強力霉素(DOX)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)、四環(huán)素(TET)、頭孢西丁(FOX)、頭孢吡肟(FEP)以及亞胺培南(IMP)16種藥物進行沙門菌耐藥性檢測，其結(jié)果與美國臨床實驗室標準化協(xié)會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)2016年標準比較，以大腸埃希菌(ATCC25922)做為質(zhì)控菌株。對三種及以上抗生素耐藥，既為多重耐藥(multidrug resistance, MDR)。

1.2.4脈沖場凝膠電泳(PFGE)： 參照PulseNet制定的沙門菌脈沖場電泳標準分型方法。沙門菌標準株H9812做為分子量標記。內(nèi)切酶 XbaI(40 U)，37 ℃酶切3 h。電泳條件：電壓6 v/cm，脈沖時間從2.2～63.8 s，線性轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換角度120°，電泳時間19 h，電泳溫度14 ℃。脈沖場凝膠電泳儀為Bio-Rad，CHEF III；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad Gel-DOCXR。內(nèi)切酶購自New England公司。采用國家致病菌識別網(wǎng)信息化平臺系統(tǒng)對電泳圖像進行處理、網(wǎng)絡化數(shù)據(jù)傳輸和比對分析。聚類樹狀圖根據(jù)非加權配對算術平均法(unweighted pair-group method using arithmetic averages，UPGMA) 構建。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件和WPS 2016專用版對數(shù)據(jù)進行頻數(shù)和百分構成分析。

2 結(jié)果

2.1血清分型及年齡組情況 2008-2018年，傷寒、副傷寒沙門菌株共65株，分布于北京市16個區(qū)。男女比例1.2∶1(35/30)，以男性居多。其中，傷寒沙門菌24株，占36.9%，主要分布于2008、2010、2013和2015-2017年，平均每年2～5株，2018年，有一起輸入性傷寒暴發(fā)分離到9株菌。甲型副傷寒沙門菌7株，占10.8%，主要分布在2013-2015和2017年；乙型副傷寒沙門菌20株，占30.8%，主要分布在2009-2011和2013-2016和2018年；丙型副傷寒沙門菌14株，占21.5%，主要集中在2009-2012年。年齡分布0～10歲組和31～40歲組最多，均占24.6%，其次是41～50歲組和21～30歲組，分別占18.5%和13.8%，11～20歲組最少占4.6%(表1)。

2.2藥敏試驗結(jié)果 65株傷寒、副傷寒沙門菌對16種抗生素的敏感和耐藥程度不同(表2)。傷寒沙門菌對萘啶酸的耐藥率最高為20.8%，其次為鏈霉素和磺胺異噁唑，而對頭孢類抗生素、阿莫西林-克拉維酸、強力霉素，阿奇霉素和亞胺培南等均100%敏感。甲型副傷寒沙門菌對氟喹諾酮類抗生素萘啶酸和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為100.0%和57.1%，對氯霉素和磺胺異噁唑的耐藥率均為14.3%，對其他抗生素均敏感。乙型和丙型副傷寒沙門菌對磺胺異噁唑的耐藥率分別為20.0%和35.7%，對其它抗生素的耐藥率均低于10%。臨床上治療腹瀉常用的頭孢菌素、環(huán)丙沙星(除甲型副傷寒外)，以及氨基糖甙類慶大霉素對4種血清型沙門菌普遍較敏感，敏感率均>75%。多重耐藥分析顯示，甲型副傷寒的多重耐藥最明顯，耐藥率達到28.6%，存在對8種抗生素的聯(lián)合耐藥。傷寒沙門菌多重耐藥率最低，為4.2%。

表1 傷寒、副傷寒沙門菌株不同年齡組、性別及血清型分布

表2 2008-2018年傷寒、副傷寒沙門菌耐藥情況

2.3PFGE分子分型 用限制性內(nèi)切酶XbaI 將傷寒、乙型副傷寒和丙型副傷寒沙門菌共58株菌，全基因組酶切后，每株菌產(chǎn)生12～20條電泳條帶，各片段分子量為20～700 kb。各菌株圖譜間DNA條帶數(shù)量和位置完全相同為同一型別，若有1條或1條以上的條帶差別，即判為不同的型別。58株菌分為34種帶型(Sal.BJ001～Sal.BJ034)，經(jīng)聚類分析，總體相似系數(shù)在32.2%～100%，帶型分散，無明顯優(yōu)勢型別(圖1)。其中2018年的9株傷寒沙門菌帶型一樣Sal.BJ0032，為一起輸入性暴發(fā)，占15.6%，但與其它型別存在明顯差異,有5種型別分別包含3株菌，各占5.2%,6種型別分別包含2株菌，各占3.4%。雖然這些菌株克隆來源一樣，但病例均來自不同的區(qū)，不同的年份，沒有流行病學上的關聯(lián)。其余22種帶型都只有1株菌。

3 討論

3.1全球范圍傷寒或副傷寒流行與菌株的優(yōu)勢血清型有關，存在變遷替換現(xiàn)象[4]。此次分析發(fā)現(xiàn),2008-2018年，北京市腸道門診監(jiān)測系統(tǒng)腹瀉患者糞便標本中傷寒、副傷寒沙門菌維持在較低水平。2008-2012年，傷寒沙門菌和乙型、丙型副傷寒沙門菌均有流行或交替出現(xiàn)，但2013年以后，則主要以傷寒沙門菌和乙型副傷寒為主，偶有甲型副傷寒的散在菌株。據(jù)文獻報道，甲型副傷寒多是在沿海地區(qū)、西南部省份和東部省份高發(fā)，江西、浙江、廣西、云南等地多次出現(xiàn)暴發(fā)疫情，并在長時間持續(xù)擴散[5]。此次研究結(jié)果顯示，65株傷寒副傷寒沙門菌以0～10歲組和31～40歲年齡組居多，與文獻報道一致[1,3]。世界衛(wèi)生組織一直認為5～15歲組是傷寒、副傷寒的高發(fā)年齡組[4]，這與低齡段兒童，免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，自身抵抗力較弱，容易受細菌和病毒的侵犯有關[6,7]。傷寒、副傷寒散發(fā)病例的主要傳播途徑為污染的食物(特別是海產(chǎn)品)。青壯年作為社會的主要生產(chǎn)力，外出工作就餐的機會多，故接觸病原體的機會較多，易患病?？傊?，應加強對低齡兒童和重點人群的監(jiān)測和防控，加強食品安全和公共衛(wèi)生監(jiān)管、保護易感人群、防止病從口入。

圖1 58侏傷寒、副傷寒沙門菌PFGE聚類分析圖

3.2PFGE是公認的細菌分子流行病研究的“金標準”，其優(yōu)勢是直接針對整個細菌染色體DNA進行分析，分辨能力強、實驗結(jié)果穩(wěn)定、重復性好[8]。北京市傷寒、副傷寒沙門菌的PFGE型別較多且分散，表明患者間菌株的遺傳親緣關系相對較遠，流行病學表現(xiàn)為高度散發(fā)，無聚集性。近10年來，北京市確實沒有傷寒或副傷寒的暴發(fā)疫情[1]。但在2018年夏天，通過北京市腸道門診病例監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)某區(qū)環(huán)建公司工人集體去外地勞務支援，時隔一個月后回京陸續(xù)發(fā)病，引起傷寒輸入性暴發(fā)，共分離到9株傷寒沙門菌，經(jīng)PFGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，該起暴發(fā)為同一克隆來源。隨即展開流調(diào)和異地協(xié)查，由于是京外感染，空間的阻隔和時間的滯后，很遺憾最終沒能追溯到感染來源，但這提出了警示：目前傷寒、副傷寒病例癥狀越來越不典型，發(fā)病周期和潛伏期長、易復發(fā)，且存在慢性帶菌。雖然流行方式多呈散發(fā)，但城市化和全球化對公共衛(wèi)生的影響越來越大，北京流動人口數(shù)量巨大，人口流動會帶來傳染源輸入風險，而且這種風險會持續(xù)存在，隨時都有暴發(fā)的可能，因而要引起廣泛關注。

3.3與既往本地區(qū)的研究數(shù)據(jù)相比[9]，傷寒、副傷寒沙門菌對磺胺異噁唑、萘啶酸、鏈霉素和氨芐西林等經(jīng)典抗生素耐藥率在增加。雖然不同血清型對各種抗生素的耐藥率有明顯差異，但總體上對阿莫西林克拉維酸、強力霉素、阿奇霉素和亞胺培南所有菌株均敏感。甲型副傷寒沙門菌的耐藥率高于傷寒沙門菌和其它兩型，這與浙江等地的研究結(jié)果一致[10]。值得關注的是，本研究顯示甲型副傷寒沙門菌對第1代喹諾酮類藥物萘啶酸100%耐藥，而氟喹諾類藥物環(huán)丙沙星的耐藥率已上升為57.1%，敏感率只有14.3%，且患者年齡<18歲禁用喹諾酮類藥物，臨床用藥應引起足夠重視。臨床上兒科常用藥大環(huán)內(nèi)酯類的阿奇霉素和第3、4代頭孢菌素對各種血清型敏感率都很高，應該是治療傷寒、副傷寒沙門菌感染的首選藥。該地區(qū)傷寒、副傷寒菌株耐藥率的逐步增高和多重耐藥株的出現(xiàn)讓人憂慮?？股氐臑E用及不規(guī)范使用是導致細菌耐藥的一個重要因素，臨床上在治療時，必須了解目前流行的血清型和耐藥模式，有針對性的合理選用抗生素，以確保其安全性和療效。因此，要持續(xù)、系統(tǒng)地開展傷寒、副傷寒病原學和耐藥監(jiān)測，以了解該地區(qū)沙門菌流行血清型及其相應的耐藥性變化規(guī)律，為臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。