復(fù)方芪藻湯調(diào)控FoxO3a/FasL/Caspase8抑制實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡

陳暢 隋璐 趙春瑩

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034)

胃潰瘍可由幽門螺桿菌感染、藥物、激素、應(yīng)激、不良生活習(xí)慣等多種原因誘發(fā)，臨床上主要表現(xiàn)為節(jié)律性、周期性、易復(fù)發(fā)性上腹痛，?？蓪?dǎo)致出血、穿孔、甚至癌變。胃潰瘍可發(fā)生于任何年齡，中老年人群中更為多見(jiàn)，男性患者多于女性〔1,2〕。當(dāng)前治療胃潰瘍的常規(guī)療法即三聯(lián)療法正面臨著用藥周期長(zhǎng)、愈合不完善、長(zhǎng)期給藥對(duì)肝腎毒副作用大、停藥易復(fù)發(fā)的問(wèn)題。與之相比，中醫(yī)藥在治療胃潰瘍方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。復(fù)方芪藻湯(FFQZT)是一味針對(duì)潰瘍病脾胃虛寒病機(jī)的中藥方劑，具有高治愈率、低副作用、同時(shí)價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。但FFQZT的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬通過(guò)外源性凋亡通路叉頭框蛋白(Fox)O3a/人凋亡相關(guān)因子配體(FasL)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白配(Caspase)8探討FFQZF修復(fù)胃黏膜損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重180～220 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 w，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 FFQZT(螺旋藻多糖18 g，黃芪20 g，白芨15 g，烏賊骨10 g)購(gòu)自沈陽(yáng)國(guó)大藥房。奧美拉唑腸溶膠囊購(gòu)自悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)14370242)。

1.3 主要試劑與儀器 兔抗大鼠FoxO3a單克隆抗體(CST)，兔抗大鼠FasL多克隆抗體、兔抗大鼠Caspase8多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，兔抗大鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體、山羊抗兔二抗(上海索萊寶生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)量試劑盒、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)試劑盒、超敏電化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，鏈霉菌抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶鏈接法(SP)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。低溫超速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus Sepatech公司)，ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，Bio-Rad 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，石蠟切片機(jī)(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組與模型制備 將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、FFQZT低劑量組、FFQZT中劑量組、FFQZT高劑量組、奧美拉唑組各10只。采用乙酸燒灼法制備胃潰瘍模型?？瞻捉M不做處理，其余各組均以3%戊巴比妥鈉麻醉。麻醉后，常規(guī)剪毛并消毒手術(shù)區(qū)，自劍突下沿腹中線稍左做約2 cm的切口，自肝后牽引出胃，在胃前壁胃竇與胃體交界處，貼附浸泡了冰醋酸的濾紙片，共貼附2次，每次30 s。吸去殘留乙酸，用大網(wǎng)膜覆蓋后將胃送回腹腔，逐層縫合腹壁。術(shù)后1 d內(nèi)禁食。自造模成功后第3天開(kāi)始灌胃，空白組及模型組給予1 ml/100 g生理鹽水灌胃；FFQZT低、中、高劑量組分別給FFQZT 3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，奧美拉唑組給奧美拉唑水溶液3.6 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥14 d。

1.5 標(biāo)本采集 大鼠第14天灌胃后，禁食不禁水24 h，次日處死取材。處死后開(kāi)腹取胃，沿較大曲率剪開(kāi)，用冰生理鹽水沖洗胃腔后，在冰袋上展平胃部。將潰瘍?cè)罴捌渲苓? mm范圍內(nèi)的組織切下，組織塊大小為1.0 cm×1.1 cm，均分為兩部分。一部分迅速投入液氮中-80℃凍存，備做Western印跡檢測(cè)；另一部分4%多聚甲醛固定1 d，制成蠟塊，備做免疫組化染色。

1.6 Western印跡檢測(cè)FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達(dá) 每個(gè)樣品剪取約20 mg的組織，充分裂解后，4℃下14 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度并計(jì)算上樣量。將煮好的蛋白加入10%SDS-PAGE中，以120 V 電泳1 h。電泳結(jié)束后取出凝膠，加入轉(zhuǎn)膜液，轉(zhuǎn)膜條件是250 mA下轉(zhuǎn)膜90 min。室溫下用脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃過(guò)夜(FoxO3a 1∶1 000、FasL 1∶1 500、Caspase8 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000)，二抗室溫1 h(羊抗兔免疫球蛋白G1∶10 000)，超敏電化學(xué)發(fā)光液曝光。Image J測(cè)定曝光條帶灰度值。

1.7 免疫組化法檢測(cè)大鼠胃黏膜上皮中FoxO3a、FasL、Caspase8的表達(dá) 4 μm切片常規(guī)脫蠟至水，乙二胺四乙酸(EDTA)微波修復(fù)后按SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性指標(biāo)為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)采用評(píng)分法進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果取均值〔3〕。根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分， ≤10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度計(jì)分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)乘積為評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，乘積≥4分為陽(yáng)性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Western印跡法檢測(cè)FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達(dá) 模型組FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白水平明顯高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，F(xiàn)FQZT高劑量組Foxo3a、FasL、Caspase8蛋白水平明顯降低(P<0.05)，F(xiàn)FQZT低、中劑量組Foxo3a、FasL蛋白和FFQZT低劑量組Caspase8蛋白差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

1～6：空白組、模型組、FFQZT低劑量組、FFQZT中劑量組、FFQZT高劑量組、奧美拉唑組圖1 Western印跡法檢測(cè)Foxo3a、FasL、Caspase8蛋白表達(dá)

組別FoxO3aFasLCaspase8空白組0.65±0.141)0.57±0.111)0.46±0.141)模型組1.06±0.321.29±0.311.14±0.29FFQZT低劑量組0.97±0.320.96±0.300.99±0.37FFQZT中劑量組0.90±0.190.89±0.490.82±0.271)FFQZT高劑量組0.71±0.101)0.77±0.331)0.61±0.231)奧美拉唑組0.85±0.201)0.80±0.171)0.78±0.141)

與模型組相比：1)P<0.05

2.2 免疫組化法檢測(cè)大鼠胃黏膜上皮中FoxO3a、FasL、Caspase8的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示FoxO3a表達(dá)位點(diǎn)位于細(xì)胞核(圖2)，F(xiàn)asL、Caspase8表達(dá)位點(diǎn)位于細(xì)胞質(zhì)(圖3、圖4)。各組FoxO3a、FasL、Caspase8表達(dá)水平存在明顯差異(P<0.01)?？瞻捉M少見(jiàn)FoxO3a、FasL、Caspase8陽(yáng)性細(xì)胞；模型組可見(jiàn)大量FoxO3a、FasL、Caspase8陽(yáng)性細(xì)胞，染色范圍廣且染色強(qiáng)度較深；與模型組相比，F(xiàn)FQZT中、高劑量組及奧美拉唑組Foxo3a、FasL、Caspase8陽(yáng)性表達(dá)均下降，而與奧美拉唑組相比，F(xiàn)FQZT高劑量組FoxO3a、FasL、Caspase8表達(dá)下降最明顯，見(jiàn)表2。

圖2 FoxO3a在大鼠胃黏膜上皮表達(dá)情況(×400)

圖3 FasL在大鼠胃黏膜上皮表達(dá)情況(×400)

圖4 Caspase8在大鼠胃黏膜上皮表達(dá)情況(×400)

組別FoxO3a陰性陽(yáng)性FasL陰性陽(yáng)性Caspase8陰性陽(yáng)性空白組9110091模型組191919FFQZT低劑量組193719FFQZT中劑量組465546FFQZT高劑量組917382奧美拉唑組827364χ2/P值29.676/<0.0121.715/<0.0123.767/<0.01

3 討 論

FFQZT是一味抗?jié)兣c養(yǎng)胃兼用的中藥方劑，具有降低胃液胃酸分泌、促進(jìn)潰瘍愈合、保護(hù)胃黏膜、提高機(jī)體免疫功能的作用。研究表明螺旋藻多糖對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍有促進(jìn)潰瘍愈合、保護(hù)胃黏膜的作用〔4〕。黃芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，益固表衛(wèi)，利水消腫，托瘡生肌之功效，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)細(xì)胞代謝，且黃芪與黃芪提取物對(duì)幽門螺桿菌有直接殺滅的作用〔5〕;烏賊骨可制酸止痛、收濕斂瘡,其成分碳酸鈣具有中和胃酸、促進(jìn)潰瘍面炎癥吸收的作用，與抗生素聯(lián)合應(yīng)用可降低不良反應(yīng)和耐藥性〔6〕;白及具有高黏度性，口服后可在胃黏膜表面形成一層保護(hù)膜,阻止胃酸、胃蛋白酶及其他理化因素對(duì)潰瘍的進(jìn)一步侵襲,同時(shí)發(fā)揮收斂、止血的功效，有利于潰瘍的愈合及修復(fù)〔7〕。

胃潰瘍的致病機(jī)制尚未完全明確，但已有研究證實(shí)，胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡在胃潰瘍發(fā)生與愈合中均有重要作用〔8〕。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡方式，這個(gè)過(guò)程與細(xì)胞增殖、分化共同貫穿于生命的始終，是生命體正常生長(zhǎng)、發(fā)育與死亡所不可缺少的。細(xì)胞凋亡的途徑有兩種，分別是由死亡受體起始的外源性途徑和線粒體起始的內(nèi)源性途徑。

FoxO3a屬于Forkhead家族中的O亞族，是該家族的核心蛋白，在各組織器官中均有廣泛表達(dá)。作為細(xì)胞生命活動(dòng)的重要參與者，F(xiàn)oxO3a在細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期等過(guò)程中都起著關(guān)鍵性作用，其中最主要的功能是調(diào)控細(xì)胞凋亡〔9〕。FoxO3a的活性受其上游因子調(diào)控，蛋白激酶B(Akt)、血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶(SGKs)、IKB激酶(IKK)等因子可抑制FoxO3a活性，c-Jun氨基末端激酶(JNK)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)等因子可增強(qiáng)FoxOsa活性。當(dāng)抑制性因素作用于FoxO3a時(shí)，會(huì)將其磷酸化，磷酸化的FoxO3a與DNA的親和力下降，與細(xì)胞核內(nèi)的14-3-3核輸出蛋白結(jié)合，發(fā)生核排斥，F(xiàn)oxO3a會(huì)被移出細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，泛素化降解，喪失轉(zhuǎn)錄活性，從而失去控制細(xì)胞凋亡的能力；當(dāng)抑制性因素作用于FoxO3a時(shí)，會(huì)促使去磷酸化的FoxO3a轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活下游凋亡相關(guān)因子，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔10,11〕。

FasL是FoxO3a下游的靶蛋白，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的重要成員，在外源性凋亡通路中起重要的作用，主要表達(dá)位點(diǎn)在T細(xì)胞。FasL和Fas常相互配合，在細(xì)胞膜上形成誘導(dǎo)凋亡的復(fù)合體，該復(fù)合體可吸引細(xì)胞質(zhì)中與帶有相同死亡結(jié)構(gòu)域蛋白的FADD結(jié)合，激活Caspase家族〔12〕。Caspase家族主要包括凋亡啟動(dòng)因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導(dǎo)因子。Caspase8是凋亡啟動(dòng)的核心，F(xiàn)asL與 Caspase8結(jié)合后，使Caspase8活化，活化的Caspase8可以引起Caspase凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，破壞細(xì)胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)蛋白及功能蛋白，最終激活凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白Caspase3，引起細(xì)胞凋亡〔13,14〕。

本研究中，模型組FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達(dá)明顯高于空白組，而在應(yīng)用了FFQZT后凋亡相關(guān)蛋白 FoxO3a、FasL、Caspase8蛋白表達(dá)明顯下降。綜上，F(xiàn)FQZT可能是通過(guò)調(diào)控FoxO3a/FasL/Caspase8通路從外源性途徑抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮修復(fù)胃黏膜的作用。