絲膠蛋白對2型糖尿病模型大鼠腎臟細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶表達(dá)的影響

宋妤軒 王丹丹 李東哲 史碩 陳志宏 宋成軍

(承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

目前，糖尿病腎病已成為僅次于原發(fā)性腎小球腎炎的導(dǎo)致終末期腎病的第二位原因〔1〕。當(dāng)糖尿病患者出現(xiàn)尿中泡沫增多、尿量改變(減少或增多)、容易疲倦等表現(xiàn)時(shí)，應(yīng)高度警惕糖尿病腎病的可能。糖尿病患者進(jìn)展至糖尿病腎病時(shí)代謝紊亂更加復(fù)雜，尤其是發(fā)展到終末期腎病，在治療上更加困難。因此，盡早防治對于延緩糖尿病腎病的進(jìn)程意義重大〔2〕。本研究提取彩色蠶繭(黃色蠶繭)中的絲膠蛋白，并給予2型糖尿病模型大鼠灌胃，觀察大鼠腎臟細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)表達(dá)的變化，為探尋高效、毒副作用輕的改善糖尿病腎臟損傷的天然物質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年雄性SD大鼠，體重200～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證書號(hào)712024)，飼養(yǎng)于承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。絲膠的提取和制備：承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供彩色蠶繭，純水浸泡蠶繭后煎煮2次，過濾、合并濾液，加熱濃縮，4℃保存，灌胃前用37℃水浴箱復(fù)溫〔3〕。購于美國Sigma公司的鏈脲佐菌素(STZ)，使用前用pH4.4的枸櫞酸鈉/枸櫞酸緩沖液配制，濃度為2%；血糖檢測試劑盒購于保定長城臨床試劑有限公司；尿素氮、肌酐檢測試劑盒購于北京首醫(yī)臨床科技中心；尿蛋白酶免分析法(EIA)檢測試劑盒購于法國SPI公司；BCA蛋白定量試劑盒購于北京泰格美科技有限公司；兔抗大鼠pERK1/2多克隆抗體(一抗)購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；山羊抗兔、小鼠IgG二抗購于美國KPL公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；ERK和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；一步法RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、制備模型和用藥 建立模型的方法：2%的STZ以25 mg/kg的劑量給予大鼠腹腔注射(連續(xù)3 d)，注射STZ 7 d后空腹血糖不低于16.7 mmol/L作為2型糖尿病大鼠造模成功的標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。24只成功建模大鼠隨機(jī)平均分為模型組和絲膠蛋白組，模型組不做任何處置，絲膠蛋白組按照2.4 g/(kg·d)的劑量灌胃給予絲膠(連續(xù)35 d)。另取12只大鼠作為正常對照組，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 取材 處死前1 d用代謝籠收集3組24 h尿液，記錄尿量。然后，在大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉，劑量為0.5 g/kg，通過內(nèi)眥使用毛細(xì)玻璃管收集眶后靜脈叢的靜脈血，3 000 r/min離心20 min(京立LD4-2A離心機(jī))，收集血清，-20℃冰箱保存。大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.2.3 檢測24 h尿蛋白含量 采用EIA方法使用相應(yīng)試劑盒檢測。

1.2.4 檢測血液指標(biāo) 應(yīng)用日立公司的Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動(dòng)臨床生化分析儀采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖，谷氨酸脫氫酶兩點(diǎn)法檢測尿素氮含量，酶法檢測肌酐含量。

1.2.5 檢測腎臟ERK蛋白和mRNA的表達(dá) (1)ERK蛋白(免疫印跡法)：提取腎臟中的總蛋白并定量，蛋白上樣量80 μg；15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)到PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉后加入一抗(β-actin 1∶1 000、pERK1/2 1∶100)4℃孵育過夜，加入二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記，1∶5 000〕室溫?fù)u床孵育，最后使用ECL化學(xué)超敏發(fā)光液顯影并掃描膠片。Quantity One軟件分析蛋白條帶，ERK蛋白的相對表達(dá)水平以ERK蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示。(2)ERK mRNA(逆轉(zhuǎn)錄-PCR法)：按Trizol試劑相關(guān)步驟提取腎臟總RNA，鑒定完整性后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對cDNA產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增(PCR引物序列及擴(kuò)增條件見表1。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min、94℃變性30 s、50～65℃退火30 s、72℃延伸1 min，第二步起循環(huán)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳(90 V，40 min)，ZF型紫外透射反射分析儀攝像。Quantity One軟件分析顯影條帶，ERK mRNA的相對表達(dá)水平以ERK條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值表示。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組血液指標(biāo)和尿蛋白檢測結(jié)果比較 與正常對照組比較，模型組空腹血糖、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，絲膠蛋白組空腹血糖、24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組血糖、尿素氮、肌酐和尿蛋白水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 各組腎臟ERK的表達(dá) 與正常對照組大鼠比較，模型組腎臟ERK蛋白和mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組大鼠比較，絲膠蛋白組腎臟ERK蛋白和mRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 3組腎臟ERK表達(dá)比較

1～3：正常對照組、模型組、絲膠蛋白組圖1 各組腎臟ERK蛋白和mRNA的表達(dá)

3 討 論

在機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的信息傳輸網(wǎng)絡(luò)中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著重要作用〔5〕。ERK是80年代末期發(fā)現(xiàn)的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的重要成員，包括ERK1和ERK2，是將信號(hào)從細(xì)胞表面的受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵。磷酸化激活的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，介導(dǎo)下游因子如Ap-1、c-fos、c-Jun等的轉(zhuǎn)錄活化，從而參與細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞癌變等多種生物學(xué)過程〔6〕。

有研究發(fā)現(xiàn)，ERK途徑與腫瘤、糖尿病腎病密切相關(guān)〔7～9〕。糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了，目前認(rèn)為系多因素參與，在一定的遺傳背景及部分危險(xiǎn)因素的共同作用下致病。有研究證實(shí)，高糖和血管緊張素(Ang)Ⅱ是糖尿病腎病的主要致病因子〔7，10,11〕。正常情況下ERK定位于細(xì)胞質(zhì)，高糖和AngⅡ可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞ERK轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核從而被激活，活化后調(diào)節(jié)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子活性致系膜細(xì)胞肥大，而系膜細(xì)胞增生、肥大是糖尿病腎病的主要病理表現(xiàn)之一〔12〕，但糖尿病腎病時(shí)ERK具體的激活機(jī)制尚不完全清楚。本研究也證實(shí)了上述研究結(jié)果，糖尿病模型大鼠血糖、腎臟ERK的表達(dá)明顯升高，腎臟功能明顯降低。

糖尿病腎病一般起病隱襲、進(jìn)展緩慢，當(dāng)發(fā)展為持續(xù)性蛋白尿時(shí)較多患者亦無明顯癥狀，隨著腎臟損害的進(jìn)一步加重，將逐漸出現(xiàn)腎功能損害(如血肌酐、尿素氮等指標(biāo)升高)、腎性高血壓、水腫等，最后病情進(jìn)展至晚期可出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰竭、尿毒癥，是糖尿病患者死亡的主要原因之一〔13〕。有研究證實(shí)，改善多種危險(xiǎn)因素可明顯延緩糖尿病腎臟損害的進(jìn)展，改善患者的生存質(zhì)量。鑒于化學(xué)合成藥物的毒副作用，學(xué)者們一直在探尋能有效降低血糖且毒副作用輕或無的天然藥物。絲膠蛋白是高分子水溶性蛋白，占蠶繭的25%～30%，我國自古就有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方。本課題組前期研究顯示，絲膠能有效降低2型糖尿病模型大鼠的血糖〔14〕。本研究結(jié)果顯示，絲膠蛋白可明顯降低糖尿病模型大鼠的血糖、腎臟ERK蛋白和mRNA的表達(dá)，而且反映腎功能的指標(biāo)如24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的含量也明顯降低。因此，本研究提示，絲膠可能通過降低血糖影響腎臟ERK的激活，從而減輕ERK介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增生、肥大，進(jìn)而改善腎臟功能。絲膠是天然物質(zhì)，可避免化學(xué)合成藥物帶來的毒副作用，因此，絲膠在治療糖尿病腎病及其他糖尿病并發(fā)癥方面的作用有待深入發(fā)掘。