衰老對大鼠腸道組織形態(tài)及自噬水平的影響

秦廷洋 代軍 馬曉春 趙宇艷 徐磊 張仕斌

(遵義醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，貴州 遵義 563000)

腸道是機(jī)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，同時也是阻擋細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的有效屏障。衰老過程中腸道是機(jī)體起始衰老的器官之一，腸道組織退行性變、炎癥反應(yīng)增加，肌層增厚，腸收縮蠕動減弱，各種消化酶水平下降，導(dǎo)致小腸消化吸收功能減退，經(jīng)常出現(xiàn)慢性便秘、排便障礙等癥狀〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，自噬與多種老年病密切相關(guān)，在年老組織中，自噬相關(guān)蛋白(Atg)等自噬誘導(dǎo)必需的蛋白表達(dá)下調(diào)，自噬活性隨著年齡增長逐漸降低〔2〕。在正常老年大腦中，Atg5、Atg7 和Beclin1表達(dá)均下調(diào)，胰島素抵抗和代謝綜合征患者體內(nèi)沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1表達(dá)下調(diào)，而骨關(guān)節(jié)炎中靶向自噬啟動因子(ULK)1、Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈(LC)3表達(dá)下調(diào)，表明衰老與自噬活性不足有關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，活化自噬確實(shí)具有抗衰老和延長壽命的作用，在小鼠中過表達(dá)自噬小體形成過程中的關(guān)鍵蛋白 Atg5 能使小鼠壽命延長17.2%，誘導(dǎo)小鼠自噬活化表現(xiàn)出抗衰老表型，如瘦體型、胰島素敏感性增強(qiáng)、運(yùn)動能力提高等〔3〕。目前通過自噬調(diào)節(jié)延緩機(jī)體衰老已成為廣泛學(xué)者的研究熱點(diǎn)，但腸道作為機(jī)體重要的組織器官，腸道組織衰老概況研究甚少，衰老過程中組織自噬水平變化尚處于未知，本試驗(yàn)旨在測定衰老過程中大鼠腸道組織的形態(tài)變化及腸道組織自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ表達(dá)情況，分析腸道組織自噬水平變化與腸道退行性變的內(nèi)在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)管理 選取200～240 g雄性SD大鼠16只，自由采食，于5月齡時，采集8只大鼠腸道組織樣品作為青年組；于24月齡時，采集8只大鼠腸道組織樣品作為老齡組。

1.2 樣品采集 大鼠腹部取十二指腸、回腸、結(jié)腸中段約3 cm，用生理鹽水沖洗干凈，迅速放在4%多聚甲醛中搖勻固定24～48 h。固定好后，制作成石蠟切片，參照徐戩等〔4〕闡述的方法制作組織切片。取十二指腸、回腸、結(jié)腸中段約3 cm，將組織剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg組織加入 150～250 μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12 000 r/min離心 15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯于-80℃冰箱，Western印跡測定組織LC3-Ⅱ表達(dá)量。顯微鏡拍照觀察，用Olympus攝影顯微鏡進(jìn)行圖像采集，用影像分析軟件Image-Pro Plus5.02分析圖片，測定各個腸段絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度/隱窩深度比值；Image1.8分析各組圖像灰度值。

1.3 主要試劑 LC3-Ⅱ與GAPDH抗體均由BIOSWAMP公司提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組腸道組織形態(tài)變化 老齡組十二指腸、回腸和結(jié)腸絨毛較青年組顯著萎縮變短(P<0.05)，十二指腸與結(jié)腸隱窩深度顯著縮短，回腸和結(jié)腸絨毛高度與隱窩深度比值顯著變小(均P<0.05)，老齡組腸道絨毛短小且破碎較多，整體表現(xiàn)為衰老，萎縮的狀態(tài)。見表1，圖1。

2.2 兩組腸道組織LC3-Ⅱ表達(dá)量 老齡組腸道組織LC3-Ⅱ表達(dá)量(0.84±0.06)較青年組(0.60±0.15)顯著升高(P<0.05)，見圖2。

表1 兩組腸道形態(tài)比較(n=8)

同行間無相同字母表示差異顯著(P<0.05)

圖1 兩組腸道組織切片(×100)

1～4泳道為青年組，5～8泳道為老齡組圖2 青年大鼠與老齡大鼠腸道LC3-Ⅱ的表達(dá)量

3 討 論

腸道衰老伴隨老年性腸道疾病的發(fā)生，自噬調(diào)節(jié)是緩解機(jī)體衰老的重要途徑。老年人的消化功能及吸收功能的減退由老年人胃腸道在組織學(xué)上的退行性變導(dǎo)致，研究發(fā)現(xiàn)，衰老與腸道關(guān)系為機(jī)體衰老出現(xiàn)胃分泌減少，腸道菌群種類減少，腸道滲透性增強(qiáng)，引起腸道功能障礙及腸道慢性炎癥等的發(fā)生，嚴(yán)重情況下會演變成炎癥性疾病或使胃腸功能喪失〔5〕。老年人腸動力障礙是由腸道細(xì)胞功能紊亂所致，研究發(fā)現(xiàn)，Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)分布于整個消化道，是胃腸道節(jié)律性活動的起搏點(diǎn)，在胃腸道動力的發(fā)生和動力障礙機(jī)制中具有重要作用〔6〕，ICC數(shù)量在老年大鼠消化道中顯著減少，便秘患者腸道動力障礙的重要原因是ICC數(shù)量減少和分布異?！?〕，老年人腸道ICC功能減退可能導(dǎo)致腸道發(fā)生動力障礙；在大鼠生理性衰老過程中，胃腸組織中的一氧化氮合酶(NOS)隨年齡的增加而逐漸減少，氮能神經(jīng)體系的衰老可能導(dǎo)致老年慢性便秘。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中高度保守的一種溶酶體依賴性降解系統(tǒng)〔8〕，主要包括自噬誘導(dǎo)階段(由mTOR等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)〔9〕)、核化階段(Vps34-Atg6/Beclin1等參與此過程〔10〕)、延伸階段(由Atg5、Atg12、Atg16 和Atg8/LC3 調(diào)控〔11〕)，自噬過程中自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，自噬溶酶體將包裹物和內(nèi)膜一起降解〔12〕。自噬與多種老年病都有密切關(guān)系，包括神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等。研究發(fā)現(xiàn)，自噬小體在多種神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓病及肌萎縮性側(cè)索硬化患者的大腦中堆積，提示自噬可能參與其中〔13〕。家族遺傳型PD患者中，PTEN基因誘導(dǎo)假定激酶(PINK)-1 和 Parkin 突變導(dǎo)致線粒體自噬受阻，受損線粒體和ROS大量堆積對神經(jīng)元造成損傷，自噬能清除錯誤折疊及易形成聚集傾向的突變蛋白,因此活化自噬對神經(jīng)退行性疾病的治療前景已得到充分證實(shí)〔13〕。自噬在腫瘤中的作用是一把“雙刃劍”，自噬能促進(jìn)原癌基因誘導(dǎo)的老化反應(yīng),預(yù)防細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化；自噬抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，對于原位的腫瘤細(xì)胞來說， 自噬通過抑制壞死及促炎免疫細(xì)胞浸潤或直接促進(jìn)抗轉(zhuǎn)移免疫因子高遷移率族蛋白(HMG)B1釋放而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移〔14〕。另一方面，自噬也能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，自噬能維持腫瘤細(xì)胞快速增長的營養(yǎng)需求，活化促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對化療、放療及腫瘤靶向治療產(chǎn)生抵抗〔15〕。自噬參與心血管疾病調(diào)節(jié)，年齡增大，心臟功能下降，在缺血階段，心肌細(xì)胞自噬的增強(qiáng)可為細(xì)胞提供能量，清除損傷的線粒體，抑制線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而對心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。然而細(xì)胞的自噬活性進(jìn)一步增強(qiáng)時，過度活化的自噬可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，加劇心肌細(xì)胞損傷〔16〕。自噬參與多種老年性疾病的發(fā)生，在腸道退行性變過程中，腸道組織自噬可能是調(diào)節(jié)腸道衰老的重要途徑。

自然衰老過程中大鼠腸道組織顯著萎縮，自噬流受阻可能加劇老齡大鼠腸道衰老。LC3-Ⅱ是哺乳動物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于自噬泡和自噬膜表面，參與自噬體的形成，是自噬小體的特異性標(biāo)志分子。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ經(jīng)過泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-Ⅱ并聚集到自噬體膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少呈正比，因此可反映自噬活性〔17〕。LC3-Ⅱ本身可以通過自噬降解，LC3-Ⅱ升高除了表示自噬小體生成增多、自噬活性增強(qiáng)外，還可以因?yàn)樽允尚◇w降解減少引起積聚，造成自噬活性升高的假象，因此，LC3-Ⅱ升高也可能是由于自噬流下游受阻，導(dǎo)致LC3-Ⅱ聚集。本研究結(jié)果提示自噬流受阻可能加劇老齡大鼠腸道退行性變，提高腸道組織自噬水平可能是緩解腸道老年性疾病的有效途徑。

腸道自噬調(diào)節(jié)可能是治療老年性腸道疾病的重要途徑。自噬是衰老過程中的重要調(diào)節(jié)機(jī)制〔18〕，隨著年齡增長，生物體細(xì)胞內(nèi)損傷的大分子和細(xì)胞器逐漸堆積，錯誤折疊蛋白增多導(dǎo)致老年病多發(fā)，而活化自噬可以清除細(xì)胞內(nèi)損傷的蛋白和細(xì)胞器，從而改善機(jī)體衰老狀態(tài)，研究還發(fā)現(xiàn)，自噬和凋亡性細(xì)胞死亡途徑之間可能存在復(fù)雜的相互作用，自噬與凋亡之間的相互作用也可能是自噬緩解衰老的重要原因〔19〕。總之，腸道衰老可能是造成老年性腸道疾病的主要原因，自噬在老齡大鼠腸道組織中顯著變化，自噬調(diào)節(jié)可能在大鼠腸道衰老過程中有重要作用。