老年高危型人乳頭瘤狀病毒感染后宮頸微環(huán)境中細胞因子變化

趙書利 李晨 蘭露莎 劉雨思 楊紅宇 何志旭 舒莉萍

(1貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心 貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室 中國醫(yī)學科學院成體干細胞轉化研究重點實驗室 貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴州 貴陽 550004;2貴陽市婦幼保健院；3大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院)

宮頸癌的發(fā)病率及死亡率均占我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，嚴重威脅女性的身心健康〔1,2〕。同各種惡性腫瘤的發(fā)病年齡相似，宮頸癌的主要受累人群以老年人群為主。流行病學研究表明，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和人乳頭瘤狀病毒(HPV)的感染密不可分，尤其是高危型HPV(HR-HPV)的持續(xù)感染〔3,4〕。隨著HPV預防性疫苗的上市及宮頸癌篩查手段的不斷更新普及，目前我國宮頸癌的發(fā)病率及死亡率已有所降低〔5,6〕。據報道女性一生有70%～80%概率感染HPV，但大多數人會依靠自身免疫將病毒清除，并不會發(fā)展至宮頸上皮內瘤變或宮頸癌，因此早期預判宮頸病變的發(fā)展方向并采取正確治療措施尤為重要〔7〕。但目前我國宮頸癌篩查項目只能單一時間節(jié)點判斷病變程度，尚不能早期預測疾病的發(fā)展，且花費高、痛苦大。研究表明，HR-HPV持續(xù)性感染可造成宮頸局部白細胞介素(IL)-2、IL-4等免疫炎性因子的變化，使輔助性T細胞(Th)中的Th1型/Th2平衡失調，輔助HR-HPV感染細胞免疫逃避，使病變持續(xù)發(fā)展〔8〕。本研究擬通過宮頸局部微環(huán)境中免疫炎性因子水平的變化對老年女性HR-HPV持續(xù)感染后疾病發(fā)生發(fā)展方向進行預測。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年6月就診于貴陽市婦幼保健院行門診陰道鏡檢查HR-HPV感染的老年女性患者150例，根據病理活檢結果分為無宮頸上皮內病變(NSIL)組、低級別宮頸上皮內病變(LSIL)組和高級別宮頸上皮內病變(HSIL)組各50例。納入標準：①年齡>60歲；②有性生活史；③有完整子宮。排除標準：①急性生殖道炎癥；②3 d內有性生活及陰道給藥；③非宮頸組織惡性腫瘤；④半年內使用免疫抑制劑或免疫調節(jié)劑等。3組一般資料比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2 標本采集 標本采集均經患者及其家屬同意?；颊呷“螂捉厥?，窺陰器打開陰道，無菌注射器抽取5 ml生理鹽水沖洗宮頸及陰道上1/3，保留10 s后于后穹窿處抽取3～4 ml，室溫狀態(tài)下以2 000 r/min離心5 min，保留上清液于-80℃，備炎性因子的檢測。宮頸刷收集脫落細胞保存于4℃，用于DNA的檢測及HPV分型。上述標本收集后取宮頸組織固定于甲醛溶液中用于病理檢測分組，觀察無出血后取出窺陰器結束標本收集。

1.3 細胞因子的檢測 使用BD CBA人細胞因子Th1/Th2/Th17試劑盒(美國BD公司)檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)-γ、IL-17A。人轉化生長因子(TGF)-β采用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(德國IBL公司)檢測。用巢式聚合酶鏈式反應及焦磷酸測序法對HPV陽性樣本進行分型檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1 各組細胞因子的比較 IL-2含量隨宮頸病變分級增加而逐漸降低，各組間比較具有顯著差異(P<0.01)；IL-6含量隨宮頸病變分級增加而逐漸升高，各組間比較具有顯著差異(P<0.01)；其余6種細胞因子含量隨宮頸病變分級增加無顯著變化(P>0.05)。見表2。

表2 各組細胞因子比較

與NSIL組比較:1)P<0.001；與LSIL組比較:2)P<0.001

2.2 各組HPV感染分型的比較 只針對HR-HPV進行分型檢測，以HPV16單獨感染最常見〔65例(43.3%)〕，其次為其他HR-HPV混合感染〔59例(39.4%)〕，而包含HPV16型的混合感染最為少見〔26例(17.3%)〕。3組HPV感染分型總體比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.68，P=0.16)。見表3。

2.3 HPV亞型間細胞因比較 HPV亞型間各細胞因子比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表3 各組感染HPV類型情況〔n(%)，n=50〕

表4 HPV亞型間細胞因子水平的比較

3 討 論

世界范圍內每年新發(fā)宮頸癌患者約50萬例，其中約半數患者死亡，宮頸癌已成為繼乳腺癌后的第二大女性健康殺手〔9〕。HPV為雙鏈環(huán)狀DNA病毒，具有較強的宿主特異性及組織特異性，能夠引起人體皮膚黏膜細胞的增殖，從而引發(fā)癌變〔10,11〕。根據HPV致病力強弱又可將其分為低危型和高危型，HR-HPV包括HPV16、HPV18、HPV58等型，其與女性的宮頸癌、男性陰莖癌及頭頸部鱗狀細胞癌等密切相關。HR-HPV持續(xù)性感染造成宮頸局部微環(huán)境中免疫炎性因子如IL-2、IL-6及IFN-γ等變化，使得Th1/Th2平衡漂移，即Th1因子劣勢發(fā)展而Th2因子優(yōu)勢發(fā)展，削弱自身免疫對腫瘤細胞發(fā)展的抑制作用，從而使病毒感染持續(xù)存在及病變進一步發(fā)展。相關研究表明，隨著宮頸病變分級的增加，Th1向Th2漂移程度越明顯，因而Th1/Th2漂移程度可側面反映疾病發(fā)展程度，可用于監(jiān)視病情進展〔12〕。目前我國宮頸癌篩查流程復雜且花費較高，并不能監(jiān)測宮頸病變的發(fā)展方向，可能延誤疾病最佳治療時機。老年患者體內雌激素水平下降，機體抵抗力降低，更易受HPV病毒感染，且老年患者健康檢查意識薄弱，常常發(fā)現(xiàn)疾病時已至病程晚期〔13〕。

Th細胞在適應性免疫應答過程中發(fā)揮重要作用，Th1相關細胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF等，主要參與細胞免疫，用以抵抗宮頸細胞病毒的侵襲；Th2相關細胞因子包括IL-4、IL-6、IL-10 等，具有抑制機體免疫殺滅腫瘤細胞的作用；Th17細胞主要分泌IL-17，包括IL-17A～17E，其中IL-17A主要發(fā)揮腫瘤免疫作用，而TGF-β在Th17細胞與T細胞調節(jié)細胞(Treg)的平衡作用中發(fā)揮重要作用。正常情況下，Th1/Th2、Treg/Th17 處于動態(tài)平衡，維持機體的正常免疫功能。本研究說明Th1細胞因子降低，而Th2細胞因子升高，隨著病變分級的增加Th1/Th2發(fā)生漂移的程度增加，機體免疫調節(jié)失去平衡，更利于腫瘤細胞的生長；而其余6種細胞因子組間差異無統(tǒng)計學意義，可能與IL-2和IL-6炎性因子對疾病的變化較為敏感，檢測靈敏度較高有關。HR-HPV分型檢測結果較為符合我國宮頸HPV病毒感染總體分布情況，且各亞型感染人數總體不具有統(tǒng)計學差異，并不會干擾各組中細胞因子的檢測。在亞組分型中感染不同HPV類型的患者中，被檢測的8種細胞因子均不具有統(tǒng)計學差異，進一步說明不同HR-HPV類型不會對細胞因子產生影響。但本研究為單中心、小樣本研究，尚需多中心、大樣本研究加以驗證。

綜上，老年女性HR-HPV感染后宮頸微環(huán)境中細胞因子的變化與腫瘤細胞生長有關，定期檢測可以預測宮頸疾病的發(fā)展方向。