茶樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶編碼基因CsGPX1功能分析

劉賽，劉碩謙,3，龍金花，吳敦超，陳宇宏，劉麗萍，劉仲華,3，田娜,3*

茶樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶編碼基因功能分析

劉賽1,2，劉碩謙1,2,3，龍金花1,2，吳敦超1,2，陳宇宏1,2，劉麗萍1,2，劉仲華1,2,3，田娜1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 教育部茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128

為明確茶樹(shù)[(L.) O. Kuntze.]谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）編碼基因的功能，本文利用茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆獲得的編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，進(jìn)行序列比對(duì)與分析，在此基礎(chǔ)上，將在煙草中進(jìn)行過(guò)表達(dá)獲得轉(zhuǎn)基因煙草，并比較野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性的差異，驗(yàn)證功能。序列分析表明，編碼序列（CDS）長(zhǎng)723?bp，編碼240個(gè)氨基酸。BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與桃樹(shù)（）的基因具有高度同源性（>85%）。編碼的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列和區(qū)別于其他家族成員的特有的結(jié)構(gòu)域——磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（PHGPX）。干旱脅迫處理結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)煙草株系抗旱性強(qiáng)于野生型。GPX酶活性測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的GPX酶活性高于野生型植株。以上研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱能力，說(shuō)明可能與茶樹(shù)的耐旱性能相關(guān)。本研究為提高茶樹(shù)的耐旱性能研究提供了新的理論途徑，并對(duì)降低茶園管理的成本具有一定的積極意義。

茶樹(shù)；谷胱甘肽；過(guò)氧化物酶；非生物脅迫；抗旱機(jī)理

植物在正常的新陳代謝過(guò)程中，在體內(nèi)會(huì)不斷產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）。而在低溫、鹽堿、干旱等逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)ROS含量會(huì)迅速上升。若植物體內(nèi)的ROS上升到一定程度，將會(huì)使植物受到傷害[1]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植物死亡。為應(yīng)對(duì)逆境產(chǎn)生的氧化脅迫，植物細(xì)胞存在兩種機(jī)制，即非酶促反應(yīng)與酶促反應(yīng)[1]，來(lái)平衡ROS的正常水平，減少ROS造成的損傷。酶促抗氧化系統(tǒng)中，抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPX）、過(guò)氧化物酶（Peroxidases，POD）、過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）等在保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷過(guò)程中扮演重要的角色[2]。

GPX是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，它通過(guò)清除機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基，使活性氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷被阻斷，使細(xì)胞免受氧化脅迫，從而增強(qiáng)植物的抗逆能力。GPX能調(diào)節(jié)植物脅迫適應(yīng)性，可以作為信號(hào)分子，與激素交聯(lián)，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[2]。已有研究表明，植物GPX是一個(gè)包含多種同工酶的家族，其中磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase，PHGPX）屬于家族中的獨(dú)特成員，KWNF（E/T/A/S）KFLV是PHGPX區(qū)別于其他家族成員的特有的結(jié)構(gòu)域。PHGPX具有特異性地還原膜上磷脂氫過(guò)氧化物的功能，其參與細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)控，可以保護(hù)DNA、磷脂、膽固醇等[3]。因此，通常認(rèn)為合成GPX酶的相關(guān)基因是非常重要的抗逆相關(guān)基因。所以研究這些基因的功能對(duì)進(jìn)一步理解植物抗逆機(jī)理，以及抗逆基因工程的改良等都具有重要意義。

植物體內(nèi)基因最初從煙草中克隆出來(lái)，之后又有學(xué)者相繼從擬南芥[4]、水稻[5]、番茄[6]、柑橘[7]、菠菜[8]、鹽芥[3]等植物中克隆和鑒定了植物基因。肖蓉等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在植物干旱和鹽脅迫時(shí)，棗樹(shù)基因在其脅迫反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，過(guò)量表達(dá)基因有助于提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱、耐鹽能力。王菲菲等[9]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)胡楊基因可顯著提高煙草的耐鹽性。陳義挺[10]研究表明，GPX活性變化與龍眼胚性細(xì)胞抗逆性具有正相關(guān)關(guān)系，其活性變化可作為植物在逆境脅迫下減輕ROS傷害的重要標(biāo)志之一。

茶樹(shù)[(L.) O. Kuntze.]是我國(guó)一種古老而重要的經(jīng)濟(jì)作物，其的研究報(bào)道尚少。喬新榮等[11]研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)基因在干旱脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，但對(duì)在茶樹(shù)抗逆方面分子機(jī)理的研究還不夠深入。隨著目前分子技術(shù)的迅速發(fā)展，通過(guò)分子技術(shù)育種已然是一種行之有效的途徑，選擇培育抗逆性強(qiáng)的茶樹(shù)良種意義重大[12]。并且通過(guò)基因工程提高作物的抗逆性是目前作物遺傳轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)，所以本研究將對(duì)于指導(dǎo)培育茶樹(shù)抗逆新品種具有重要意義。

本課題組前期比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理的茶樹(shù)中基因表達(dá)水平急劇升高（數(shù)據(jù)未發(fā)表），為此我們推測(cè)可能具有抗旱的功能。為進(jìn)一步驗(yàn)證的功能，本研究利用茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得了編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，并對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其功能。在此基礎(chǔ)之上，構(gòu)建了植物表達(dá)載體，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將轉(zhuǎn)入煙草，而后不斷自交直至獲得T3代種子，以此為材料進(jìn)行干旱脅迫試驗(yàn)，并進(jìn)行GPX酶的活性測(cè)定，深入分析該基因的功能。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)所用的茶樹(shù)材料來(lái)自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)茶園基地，采摘其芽頭立即用液氮處理3?min，于–80℃超低溫冰箱保存。煙草培養(yǎng)條件為室溫(25±1)℃，12?h光照周期，相對(duì)濕度60%~80%。

1.2 化學(xué)試劑及試劑盒

試驗(yàn)所用的主要化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于長(zhǎng)沙試劑公司；pCXSN植物表達(dá)載體由美國(guó)俄亥俄大學(xué)王國(guó)梁教授構(gòu)建[13]；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；first-strand cDNA synthesis kit，Prime STAR HS DNA Polymerase，TaKaRa MiniBEST Agrose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，DNA A-Tailing Kit和T4 DNA Ligase等購(gòu)于Takara公司；Free DNase Set試劑盒購(gòu)于Qiagen公司。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)Tri-Reagent試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用Free DNase Set試劑盒去除DNA。用Nanodrop 2000檢測(cè)總RNA濃度和質(zhì)量。取1?μL RNA，通過(guò)凝膠電泳測(cè)定RNA樣品的純度及完整性。根據(jù)Takara cDNA第一鏈合成試劑盒，以茶樹(shù)葉片RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.4 CsGPX1基因擴(kuò)增

根據(jù)基因的cDNA序列使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ORF序列，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。用Prime STAR HS DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物：上游引物GPXOF：5'-ATGGCTTCTTCCTCTTCA-3'；下游引物GPXOR：5'-AAACTCGTTGCAGCA-3'。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃變性10?s，55℃退火5?min，72℃延伸1.5?min，循環(huán)30次。

1.5 CsGPX1的生物信息學(xué)分析

采用Clustal W軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用DNAMAN和BioEdit軟件進(jìn)行ORF（Open reading frame）翻譯、蛋白質(zhì)基本性質(zhì)等分析，GenBank BLAST和蛋白質(zhì)序列的CDD搜索在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行，運(yùn)用ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam）在線預(yù)測(cè)氨基酸的組成與理化性質(zhì)。

1.6 CsGPX1植物過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

利用TaKaRa切膠回收試劑盒回收目的片段，并連接A尾，將加了A尾的基因片段與XcmI酶切后的pCXSN質(zhì)粒用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接體系具體如下：載體片段：50~60?ng，目的片段：150?ng，T4-DNA Ligase：0.5?μL，T4-DNA Ligase Buffer：2?μL，ddH2O定容至20?μL。16℃下連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5。通過(guò)菌落PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性菌落進(jìn)一步送至上海生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證正確的菌落，通過(guò)液體培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證。

1.7 CsGPX1過(guò)表達(dá)載體的煙草轉(zhuǎn)化

用凍融法將重組質(zhì)粒pCXSN-CsGPX1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中[14]，然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將重組質(zhì)粒pCXSN-CsGPX1采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草[15]。侵染后的外植體置于1/2MS固態(tài)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽的生成（培養(yǎng)基含1/2MS+1?mg·L-16-BA+0.15?mg·L-1NAA +400?mg·L-1頭孢霉素+60?mg·L-1潮霉素）。待長(zhǎng)出抗性芽后，進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)（培養(yǎng)基含1/2MS+0.15?mg·L-1NAA+400?mg·L-1頭孢霉素+15?mg·L-1潮霉素）。生根一周后移栽至營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)。

1.8 轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定及純化

用CTAB法[16]提取轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，PCR法驗(yàn)證目的基因是否成功轉(zhuǎn)入煙草。陽(yáng)性煙草植株進(jìn)行自交，獲得T0代種子，滅菌后均勻撒在含有60?mg·L-1潮霉素的1/2MS篩選培養(yǎng)基上，待煙草長(zhǎng)出兩片真葉后轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)土中進(jìn)行培養(yǎng)，并采用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，收集PCR陽(yáng)性結(jié)果的煙草種子，重復(fù)上述篩選方法，直至得到轉(zhuǎn)基因煙草純合體（T3代）。

1.9 CsGPX1過(guò)表達(dá)植株抗旱試驗(yàn)

將野生型煙草（WT）和轉(zhuǎn)基因煙草植株的T3代種子（分為O1、O2、O3三組）均勻撒在墊有潤(rùn)濕濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，于25℃培養(yǎng)。待煙草長(zhǎng)出兩片真葉時(shí)，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，每組8株，共32株。待長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定時(shí)，澆水至飽和，采用不澆水的處理開(kāi)始進(jìn)行干旱脅迫。待所有株系都表現(xiàn)出葉片黃化、萎蔫時(shí)，加水至飽和狀態(tài)。如此重復(fù)操作，使煙草處于干旱環(huán)境。觀察煙草恢復(fù)活性的情況，并拍照記錄。

1.10 過(guò)表達(dá)CsGPX1煙草植株生理生化指標(biāo)測(cè)定

生理生化指標(biāo)測(cè)定參照李合生的方法[17]，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)試盒測(cè)定。

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 23.0、Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。干旱脅迫處理結(jié)果使用T檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；GPX酶活測(cè)定結(jié)果使用單因素方差分析方法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsGPX1基因克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因。序列分析表明，該基因含有1個(gè)長(zhǎng)度為723?bp的ORF，編碼240個(gè)氨基酸（圖1）。

圖1 CsGPX1的核苷酸序列和氨基酸序列

2.2 蛋白序列的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了預(yù)測(cè)基因的功能，采用NCBI BLASTP進(jìn)行序列同源性分析，并用MEGA 4.1將該基因的氨基酸序列與其他物種的GPX氨基酸序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖2所示。編碼的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列——3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）：VNVAS（K/R/Q/E）CGLT，LAFPCNQF和KWNF（E/T/A/S）KFLV，并且KWNF（E/T/A/S）KFLV是區(qū)別于其他家族成員的PHGPX特有的結(jié)構(gòu)域；GPX同工酶含有3個(gè)保守半胱氨酸（C）殘基催化位點(diǎn)，其中前兩個(gè)分別位于第Ⅰ、第Ⅱ結(jié)構(gòu)域內(nèi)，第3個(gè)位于結(jié)構(gòu)域外（圖2的黑三角）[2-3]。由編碼的氨基酸序列與其他植物GPX氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）可知，編碼的氨基酸序列與月季（、XP_024162855.1）、桃樹(shù)（、XP_007223774.1）和歐洲甜櫻桃木（、XP_021821043.1）的GPX氨基酸序列的親緣關(guān)系比較近。

2.3 編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用ProtParam tool在線預(yù)測(cè)CsGPX1蛋白的氨基酸組成與理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，CsGPX1的預(yù)測(cè)分子式為C1205H1844N306O349S6，分子量為26.394?1?kD，理論等電點(diǎn)（pI）為9.31，負(fù)電荷殘基Asp和Glu分別為9個(gè)和10個(gè)，正電荷殘基Arg和Lys分別為4個(gè)和24個(gè)。

注：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)域表示GPX的保守結(jié)構(gòu)域；▼表示GPX酶的活性中心殘基。CoGPX：長(zhǎng)蒴黃麻，OMO90689.1；PpGPX1：桃樹(shù)，XP 007223774.1；JcGPX1：麻風(fēng)樹(shù)，NP 001292953.1；PeGPX1：胡楊樹(shù)，NP 001306722.1；QsGPX1：栓皮櫟，XP 023923965.1；RcGPX1：月季，XP 024162855.1

注：M：Trans 100 bp Plus II DNA Ladder，P：CsGPX1基因

2.4 CsGPX1過(guò)表達(dá)載體檢測(cè)

以茶樹(shù)葉片的cDNA作為模板，在高保真酶的作用下，通過(guò)特異性引物擴(kuò)增出了基因，目的基因的片段大小在750?bp左右（圖4），擴(kuò)增產(chǎn)物為明亮、單一條帶，符合預(yù)測(cè)結(jié)果。用XcmI酶對(duì)pCXSN質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將長(zhǎng)片段切膠回收，利用T4連接酶與目的片段進(jìn)行連接，獲得過(guò)表達(dá)載體pCXSN-CsGPX1。通過(guò)熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5，挑選單一菌落，菌落PCR驗(yàn)證采用特異性引物對(duì)（GPXOF/CXSNOF）進(jìn)行，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明pCXSN-CsGPX1載體序列正確。

2.5 過(guò)表達(dá)CsGPX1煙草植株篩選與驗(yàn)證

用CXSNOF/CXSNOR引物進(jìn)行驗(yàn)證pCXSN-CsGPX1載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101是否成功。2~6的泳道中（圖5）均為明顯單一的條帶，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的泳道7中沒(méi)有條帶，結(jié)果表明過(guò)表達(dá)載體pCXSN-CsGPX1已經(jīng)成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。

以野生型煙草的總DNA為對(duì)照，以轉(zhuǎn)基因煙草的總DNA為模板，通過(guò)特異性引物對(duì)（GPXOF/CXSNOF）進(jìn)行PCR檢測(cè)。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，野生型煙草泳道（2）無(wú)特異性條帶，而轉(zhuǎn)基因煙草泳道（3~8）（圖6）出現(xiàn)明亮、單一的特異性條帶，大小在750?bp左右，結(jié)果完全符合試驗(yàn)預(yù)期，由此說(shuō)明基因已經(jīng)成功導(dǎo)入煙草中，即成功得到了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

注：M：100 bp Plus II DNA Ladder，P：基因

Note: M:100 bp Plus II DNA Ladder. P:Gene

圖4基因PCR 擴(kuò)增電泳

Fig. 4 The electrophoresis analysis of PCR amplification production of

2.6 過(guò)表達(dá)CsGPX1煙草植株抗性結(jié)果分析

在野生型和轉(zhuǎn)基因煙草苗成株期進(jìn)行干旱脅迫后，如圖7-A結(jié)果所示，野生煙草植株開(kāi)始表現(xiàn)出葉片黃化、萎蔫，而轉(zhuǎn)基因煙草株系生長(zhǎng)基本正常。且野生型煙草植株與轉(zhuǎn)基因株系相比，其植株矮小。干旱脅迫進(jìn)行到如圖7-B時(shí)，所有株系都表現(xiàn)出葉片黃化、萎蔫。此時(shí)，給所有植株澆水至飽和。結(jié)果如圖7-C所示，轉(zhuǎn)基因煙草株系87.5%恢復(fù)活性，而野生型煙草株系只有12.5%恢復(fù)活性。過(guò)表達(dá)煙草植株（O1—O3）和野生型煙草植株（WT）經(jīng)干旱脅迫后恢復(fù)活性植株的數(shù)量統(tǒng)計(jì)如圖8所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因組植株復(fù)活數(shù)量具有極顯著性差異（<0.01）。由上可證明過(guò)表達(dá)煙草耐旱性明顯提高。

注：1：Trans 100bp Plus II DNA Ladder；2~6：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101；7：用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌

注：1：Trans 100bp Plus II DNA Ladder；2：野生型煙草DNA；3~8：轉(zhuǎn)基因煙草DNA

注：A：葉片開(kāi)始萎蔫；B：葉片全部萎蔫；C：葉片恢復(fù)活性

注：使用T檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（**：同WT組比較，差異極顯著，P＜0.01）

2.7 過(guò)表達(dá)CsGPX1煙草植株GPX活性測(cè)定結(jié)果與分析

對(duì)過(guò)表達(dá)煙草植株的GPX酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖9所示。從圖中可以看出3組轉(zhuǎn)基因株系O1—O3的GPX活性都高于野生型株系WT；其中轉(zhuǎn)基因株系O1的酶活性最高，達(dá)野生型株系WT的4.4倍，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明具有極顯著性差異（<0.01）。

3 討論

植物GPX是一個(gè)包含有多種同工酶的家族，這些同工酶在酶學(xué)特點(diǎn)、一級(jí)結(jié)構(gòu)、亞基結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位上顯著不同，但都具有高度保守區(qū)域[18]。研究表明，GPX在植物體內(nèi)可能具有多個(gè)家族成員，在不同的環(huán)境條件、樹(shù)種、組織里每個(gè)家族成員可能表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平和表達(dá)模式[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中存在8個(gè)GPX酶的基因序列（AtGPX1—AtGPX8）[19-20]。本研究克隆并獲得了茶樹(shù)基因，通過(guò)蛋白序列的同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，其所編碼的氨基酸序列具有植物GPX的3個(gè)特征保守結(jié)構(gòu)域，并且具有區(qū)別于其他家族成員的PHGPX特有的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也含有GPX活性中心的3個(gè)保守的半胱氨酸殘基，因此，本研究所克隆的基因編碼的蛋白屬于植物GPX家族成員。

注：**同WT組比較：P＜0.01差異極顯著

有研究[21]發(fā)現(xiàn)，在受到機(jī)械損傷脅迫時(shí)，過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物比對(duì)照組受到的影響小；而當(dāng)受到病菌感染時(shí)，與對(duì)照相比，過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的壞死病灶更顯著增加。該研究表明，當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，過(guò)表達(dá)減緩了非生物脅迫給植物帶來(lái)的傷害；然而，當(dāng)植物受到生物脅迫時(shí)，過(guò)量表達(dá)抵消了植物自身的防御反應(yīng)并增加了植株死亡的發(fā)生[21]。本研究對(duì)獲取的轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行干旱脅迫處理，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)株系具有良好的耐旱性。這對(duì)于進(jìn)一步探索基因以及茶樹(shù)GPX家族的生物學(xué)功能、非生物抗性機(jī)理與茶樹(shù)抗逆基因改良工程中的利用具有重大意義。

GPX是抗氧化酶體系中的重要成員，可催化谷胱甘肽（GSH）轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），將有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物，同時(shí)也可以促進(jìn)H2O2的分解，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不遭受損害[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)的抗性與體內(nèi)可溶性糖含量有關(guān)，并且可溶性糖含量增加可引發(fā)一系列的生理代謝反應(yīng)，在一定程度上，隨著可溶性糖的含量增加，植株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力增強(qiáng)[23]。植物的光合作用對(duì)逆境反應(yīng)敏感，光合作用的強(qiáng)弱對(duì)于植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量都有重要影響[24]。過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）是植物抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的保護(hù)酶，是以鐵卟啉為輔基的酶類(lèi)[25-26]。CAT和POD可以將活性氧分解為氧氣和水，從而減少體內(nèi)的活性氧積累，使植物免受其毒害。

本研究也對(duì)過(guò)表達(dá)基因的煙草進(jìn)行了與抗逆相關(guān)生理生化檢測(cè)，包括其可溶性糖含量、光合速率、CAT酶活性、POD酶活性及GPX酶活性的測(cè)定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草的這些生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果都高于野生型煙草；但可溶性糖含量、光合速率、CAT酶活性、POD酶活性的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，而GPX酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系O1的酶活性最高，是野生型株系WT的4.4倍，具有極顯著性差異（<0.01）。但是，抗性試驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖8）與酶活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)（圖9）表現(xiàn)趨勢(shì)并不完全一致，我們推測(cè)出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中轉(zhuǎn)基因煙草除了本身所含內(nèi)源GPX酶之外還含有通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得的CsGPX1酶，而CsGPX1酶在轉(zhuǎn)基因煙草中穩(wěn)定存在，可能是使轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性能提高的主要原因，但是內(nèi)源僅僅在干旱脅迫之后誘導(dǎo)表達(dá)，且內(nèi)源基因表達(dá)時(shí)期存在個(gè)體差異，因此有些樣品檢測(cè)到的是內(nèi)源基因表達(dá)高峰期，有些樣品檢測(cè)到的是表達(dá)低峰期，導(dǎo)致酶活性測(cè)定數(shù)據(jù)與抗旱結(jié)果不能完全一一對(duì)應(yīng)，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。綜上所述，我們可以進(jìn)一步推斷，基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了煙草的非生物抗性，說(shuō)明基因具有提高茶樹(shù)非生物抗性的功能。但是，在非生物逆境下的具體機(jī)制，尚需更進(jìn)一步的研究探索。

[1] 肖蓉, 慧珍, 張小娟, 等. 干旱和鹽脅迫條件下棗樹(shù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因（）的差異表達(dá)及功能分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(14): 2806-2817.

[2] 喬新榮, 張繼英. 植物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPX)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2016, 32(9): 7-13.

[3] 馬亭亭, 周宜君, 高飛, 等. 鹽芥谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因（）的克隆及表達(dá)分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2012, 13(2): 252-258.

[4] Sugimoto M, Sakamoto W. Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene frominduced by oxidative stress [J]. Genes & Genetic Systems, 1997, 72(5): 311-316.

[5] Li W J, Feng H, Fan J H, et al. Molecular cloning and expression of a phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase homolog in[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1493(1/2): 225-230.

[6] Depege N, Drevet J, Boyer N. Molecular cloning and characterization of tomato cDNAs encoding glutathione peroxidase-like proteins [J]. European Journal of Biochemistry, 1998, 253(2): 445-451.

[7] Avsian-Kretchmer O, Eshdat Y, Gueta-Dahan Y, et al. Regulation of stress-induced phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase expression in citrus [J].Planta, 1999, 209(4): 469-477.

[8] Sugimoto M, Furui S, Suzuki Y. Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase from spinach [J]. Biosciences Biotechnology and Biochemistry, 1997, 61(8): 1379-1381.

[9] 王菲菲, 丁明全, 鄧澍榮, 等. 胡楊谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化植株耐鹽性分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2012, 31(3): 231-239.

[10] 陳義挺. 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的48和基因克隆與表達(dá)[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2009.

[11] 喬新榮, 張繼英. 茶樹(shù)基因克隆及干旱脅迫下的表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(8): 42-44.

[12] 譚和平, 周李華, 錢(qián)杉杉, 等. 茶樹(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2009, 27(3): 323-326.

[13] Chen S, Songkumarn P, Liu J, et al. A Versatile zero background T-vector system for gene cloning and functional genomics [J]. Plant Physiology, 2009, 150(3): 1111-1121.

[14] Lazo G R, Stein P A, Ludwig R A. A DNA transformation-competentgenomic library in[J]. Biotechnology. 1991, 9(10): 963-967.

[15] 趙東, 劉祖生, 陸建良, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹(shù)轉(zhuǎn)化研究[J]. 茶葉科學(xué), 2001, 21(2): 108-111.

[16] 張金麗, 張羅霞, 楊坤梅, 等. 改良CTAB法對(duì)山茶屬植物基因組DNA提取的比較研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 39(4): 785-791.

[17] 李合生. 現(xiàn)代植物生理學(xué)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011: 100.

[18] Faltin Z, Holland D, Velcheva M, et a1. Glutathione peroxidase regulation of reactive oxygen species level is crucial for in vitro plant differentiation [J]. Plant Cell Physiology, 2010, 51(7): 1151-1162

[19] Gaber A, Ogata T, Maruta T, et al. The Involvement ofglutathione peroxidase 8 in the suppression of oxidative damage in the nucleus and cytosol [J]. Plant and Cell Physiology, 2012, 53(9): 1596-1606.

[20] Milla M, Maurer A, Huete A R, et al. Glutathione peroxidase genes inare ubiquitous and regulated by abiotic stresses though diverse signaling pathways [J]. The Plant Journal, 2003, 36(5): 602-615.

[21] Herbette S, Labrouhe D T, Drevet J R, et al. Transgenic tomatoes showing higher glutathione peroxydase antioxidant activity are more resistant to an abiotic stress but more susceptible to biotic stresses [J]. Plant Science, 2011, 180(3): 548-553.

[22] 齊增園, 陶鵬, 李必元, 等. 白菜谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因的鑒定與分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 28(01): 64-69.

[23] 徐澤, 胡翔, 鄧敏. 干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)的幾種抗旱性生理指標(biāo)的影響[C]//中國(guó)茶葉學(xué)會(huì), 臺(tái)灣茶協(xié)會(huì). 第四屆海峽兩岸茶業(yè)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集. 2006: 113-118.

[24] 張進(jìn). 泛素基因在煙草耐鹽性中的作用及其生理機(jī)制研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[25] 蔡永智. 轉(zhuǎn)和基因棉花抗旱性分析[D]. 石河子: 石河子大學(xué), 2013.

[26] 杜世章, 代其林, 劉婷婷, 等.60Coγ射線輻照對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化酶活性的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2011, 25(3): 456-460, 497.

Functional Analysis of Glutathione Peroxidase Encoding Genein

LIU Sai1,2，LIU Shuoqian1,2,3，LONG Jinhua1,2，WU Dunchao1,2，CHEN Yuhong1,2，LIU Liping1,2，LIU Zhonghua1,2,3，TIAN Na1,2,3*

1. College of Horticulture and Hardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 3. Key Lab of Tea Science, Ministry of Education, Changsha 410128, China.

To clarify function of glutathione peroxidase-encoding genein(L.) O. Kuntze, the full-length sequence of the coding region ofwas obtained by transcriptome data of tea plant, and sequence analysis and function prediction were performed. Then, thewas overexpressed in tobacco. Subsequently, the difference in drought tolerance between wild-type and transgenic tobacco was compared to verify the function of. Sequence analysis indicates thatwas 723?bp in length, encoding 240 amino acids. The Blast alignment reveals that theshowed more than 85% of identity in amino acid withfrom. The amino acid sequence encoded byhas a conserved characteristic sequence of the GPX protein and a phospholipid hydrogen glutathione peroxidase (PHGPX) which is unique to other family members. The results of drought stress treatment show that the drought resistance of the over-expressing ofin tobacco lines was stronger than that of wild-type. The results of GPX enzyme activity assay show that the GPX enzyme activity of the transgenic plants was higher than that of the wild type plants. All of above results verify that the over-expression ofimproved the drought tolerance of transgenic tobacco, suggesting thatmight be related to the drought resistance in tea plants. This study could provide a new strategy to improve the drought resistance of tea plants, which would significantly reduce the management cost of tea plantation.

, glutathione, peroxidase, abiotic stress, drought resistance mechanism

S571.1；Q52

A

1000-369X(2019)04-382-10

2019-03-08

2019-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31670689）、湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018NK2032）

劉賽，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)分子生物學(xué)方面的研究，liusai0417@foxmail.com。 *通信作者：tianna5678@163.com