正交試驗、響應(yīng)面法優(yōu)化加味三根湯的提取工藝比較△

李華妮，鄭連營，葛文靜，王艷艷，劉長河*

1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南省兒童醫(yī)院/鄭州大學附屬兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450003

加味三根湯由西洋參、蒲公英、鮮白茅根和鮮蘆根藥食兩用中藥組成，民間常用于預防感冒、小兒春季流行病。經(jīng)過有關(guān)部門檢測，其水提取物具有提高機體免疫力作用。方中主藥西洋參具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、提高免疫力、保護心血管系統(tǒng)等功效[1-4]。西洋參的主要活性成分為總皂苷，其中人參皂苷Re、Rb1、Rg1的含量較高[5]。白茅根主要含有黃酮類、糖類、有機酸類、三萜類等化合物，具有涼血止血、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤等作用[6]。蘆根為禾本科植物蘆葦?shù)母o，也是一種常見的中藥，其含量較大的是多糖類成分，還含有酚酸類、甾體類、黃酮類和蒽醌類等成分，具有抗氧化和保肝的作用[7-8]。蒲公英中主要成分有黃酮類、酚酸類、萜類及倍半萜類化合物，具有抗炎、抗腫瘤和抑菌等作用[9-10]。目前，關(guān)于加味三根湯的提取工藝研究還未見報道。

為了更好地開發(fā)該湯劑，得到安全、有效的保健食品，本實驗以總皂苷提取量為評價指標，采用正交試驗和響應(yīng)面法優(yōu)選加味三根湯的提取工藝，并將兩種方法進行比較，確定適宜的提取方法，為加味三根湯的生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

紫外吸光光度計(島津，日本)；XAD205DU電子分析天平(德國METTLE TOLEDO公司)。

1.2 材料

人參皂苷Re(中國食品藥品檢定研究院，批號：110754-200822)；其余試劑均為分析純。

西洋參、蒲公英、鮮白茅根、鮮蘆根等藥材購于平頂山市仲華堂中藥飲片有限公司，由河南省中醫(yī)藥研究院張留記研究員鑒定分別為五加科人參屬多年生草本植物的干燥根、菊科植物蒲公英的干燥全草、禾本科植物白茅的新鮮根莖和禾本科植物蘆葦?shù)男迈r根莖。

2 方法

2.1 總皂苷測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re對照品8.1 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 加味三根湯提取液的制備 按處方量(西洋參9.0 g、鮮白茅根50 g、鮮蘆根50 g、蒲公英17.5 g)稱取藥材，用適量的水煎煮一定的時間，煎煮兩次后將提取液合并，濃縮至約1000 mL，轉(zhuǎn)移至1000 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，靜置，作為儲備液。

對照試驗：按處方量(鮮白茅根50 g、鮮蘆根50 g、蒲公英17.5 g)稱取藥材，去掉西洋參，用適量的水煎煮一定的時間，煎煮兩次后將提取液合并，濃縮至約1000 mL，轉(zhuǎn)移至1000 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，靜置，作為儲備液。

2.1.3 測定方法 按照保健食品中總皂苷的含量測定方法(《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)》)進行測定[11]。用10 mL注射器作層析管，內(nèi)裝3 cmAmberlite-XAD-2大孔樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先后用25 mL 70%乙醇和25 mL水洗柱，棄去洗脫液，精確加入1.0 mL已處理好的儲備液，用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，然后用25 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，低溫揮干，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液、0.8 mL高氯酸，于60 ℃水浴上加熱10 min，取出，冰浴冷卻后，準確加入冰乙酸5.0 mL，混勻后，在400～800 nm波長進行掃描，根據(jù)掃描圖譜(見圖1)，最終選取在560 nm波長處測定吸光度。

注：A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液。圖1 對照品及樣品波長掃描圖

2.1.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取上述人參皂苷Re對照品溶液10、20、40、60、80、100 μL至蒸發(fā)皿中，低溫揮干，用水1 mL使溶解。按2.1.3項下方法測定吸光度。標準曲線以人參皂苷Re濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性回歸，標準曲線為Y=0.020 9X+0.017 1，r=0.995 4，表明人參皂苷在2.7～27.0 mg·L-1線性良好。

2.1.5 方法學考察 專屬性實驗表明，陰性對照對總皂苷的測定無干擾，該測定方法精密度良好(RSD為1.21%)，重復性較好(RSD為1.58%)，平均加樣回收率為98.10%，RSD為1.01%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD為1.07%)，精密吸取加味三根湯提取液1 mL，低溫揮干，殘渣加水1 mL使溶解，按照2.1.3項下的方法進行測定。由外標一點法計算樣品中的總皂苷濃度，再按公式計算總皂苷含量。

(1)

2.1.6 正交試驗設(shè)計 根據(jù)預實驗結(jié)果，以提取次數(shù)(A)、提取時間(B)、液料比(C)為考察因素，選用L9(34)正交表進行試驗，因素水平見表1。正交試驗采用電熱套加熱燒瓶內(nèi)回流提取，煎煮過程水分不損失，與生產(chǎn)過程相似。

表1 正交試驗因素與水平

2.1.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計 利用Box-Behnken響應(yīng)面法的設(shè)計原理，以提取次數(shù)、提取時間、液料比為自變量，確定響應(yīng)面試驗各參數(shù)，見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平

2.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS軟件對正交試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；采用Design expert 8.0.6軟件對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 正交試驗的結(jié)果與分析

正交試驗采用電熱套加熱燒瓶內(nèi)回流提取，煎煮過程水分不損失，與生產(chǎn)過程相似。以總皂苷的含量為指標，進行分析，結(jié)果及方差分析見表3～4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析

注：F0.05(2，2)=19，*差異有統(tǒng)計學意義；F0.01(2，2)=99，**差異有統(tǒng)計學意義。

表3中的K1、K2、K3分別表示每個因素的3次試驗所得的總皂苷含量的平均值，R表示平均數(shù)的極差。由表3極差R可得到各因素對總皂苷含量的影響順序為提取次數(shù)>液料比>提取時間。由表4方差分析結(jié)果可知，提取次數(shù)對總皂苷含量的影響較顯著，提取時間和液料比對總皂苷含量的影響則不顯著。直觀根據(jù)3個因素的K1、K2、K3，確定最佳提取工藝為A2B2C3，即水提取正交試驗最佳提取工藝為：液料比10∶1，提取2次，每次1.5 h。根據(jù)最佳提取條件進行驗證實驗，所得總皂苷質(zhì)量分數(shù)的平均值為2.90 mg·g-1(RSD=2.1%)，總皂苷含量數(shù)據(jù)穩(wěn)定，提示工藝穩(wěn)定可靠。

3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

3.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 在正交試驗的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面法的設(shè)計原理，以提取次數(shù)、提取時間、液料比為自變量，以總皂苷的含量為響應(yīng)值設(shè)計3因素3水平(17個試驗點)的響應(yīng)面分析試驗，這17個試驗點分為12個析因點(表中編號1～3、5～7、9～10、14～17)和5個中心點(表中編號4、8、11～13)，試驗的方案及結(jié)果見表5。

表5 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果

表6 方差分析

3.2.2 模型的建立和顯著性分析 采用Design-Expert 8.0.6.1響應(yīng)面分析軟件對表5中的17組試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到的二元回歸方程：Y=3.204+0.198 75A-0.021 25B+0.045C+0.027 5AB-0.075AC+0.03BC-0.263 25A2+0.021 75B2-0.105 75C2。由表6方差分析結(jié)果可知，模型差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，以上數(shù)據(jù)充分說明了該模型的擬合度較好，可以用該模型表示響應(yīng)值(總皂苷的含量)與自變量(提取次數(shù)、提取時間、液料比)間的多元回歸關(guān)系。在各個作用因素中，一次項提取次數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提取時間、液料比差異無統(tǒng)計學意義，并且3個影響因素的交互作用不顯著，并由表6中的F值可知，各因素對總皂苷含量的影響順序為提取次數(shù)>液料比>提取時間，所得的結(jié)論與正交試驗是相符的。二次項中，只有A2(提取次數(shù)和提取次數(shù)交互作用)差異具有統(tǒng)計學意義，其余均沒有統(tǒng)計學意義。

3.2.3 響應(yīng)面的交互作用分析 在提取次數(shù)、提取時間、液料比3個因素中任意取兩個分別作為X和Y，以總皂苷的含量作為Z，采用Design-Expert 8.0.6.1響應(yīng)面分析軟件作出相應(yīng)的三維圖。通過響應(yīng)面和等高線可以直觀的分析因素的交互作用對總皂苷含量的影響。在響應(yīng)面圖中，曲面表現(xiàn)越陡峭，則該因素對總皂苷含量的影響越大[12-14]；由圖2可知，提取次數(shù)和液料比對總皂苷含量的影響較大，表現(xiàn)為隨著提取次數(shù)和液料比的增加或減少，總皂苷含量變化較大。提取時間對總皂苷含量的影響較小，表現(xiàn)為隨著提取時間的增加或減少，總皂苷含量變化較小。提取次數(shù)和提取時間(圖2A)、提取時間和液料比(圖2C)的響應(yīng)曲面表現(xiàn)的較為平滑，說明這些因素的交互作用不明顯；提取次數(shù)和液料比的響應(yīng)面(圖2B)表現(xiàn)的比較陡峭，并且其等高線圖也最接近橢圓形，說明這兩個因素間的交互作用較強。由此可見，提取次數(shù)和液料比對總皂苷含量的影響較大，提取時間對總皂苷含量的影響較小，但是提取時間對總皂苷含量也有一定的協(xié)同作用。

圖2 兩因素交互作用對總皂苷含量的響應(yīng)面圖

3.3 最佳條件的確定及驗證

通過Design-Expert 8.0.6.1響應(yīng)面分析軟件求解回歸方程，得到加味三根湯的最佳提取條件是：液料比8.42∶1，提取2.4次，每次2 h，在此提取條件下所得的理論總皂苷質(zhì)量分數(shù)為3.30 mg·g-1，為方便實驗操作，將上述提取條件修正為液料比8∶1，提取2次，每次2 h進行驗證實驗，平行3次所得的總皂苷質(zhì)量分數(shù)的平均值為3.21 mg·g-1(RSD=1.11%)，與理論總皂苷提取值相差2.7%，由此可見，該多元二次方程建立的響應(yīng)面模型預測總皂苷含量是可行的。

4 討論

本研究采用的是《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范(2003年版)》中總皂苷的含量測定方法，其精密度、穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率試驗的RSD分別是1.21%、1.07%、1.58%、2.31%，以上數(shù)據(jù)說明儀器的精密度良好，加味三根湯供試品溶液穩(wěn)定性較好，該方法用于總皂苷的測定是可行的。此外，扣除掉西洋參藥材，其他3種藥材同法制備成供試品溶液，結(jié)果表明鮮白茅根、鮮蘆根和蒲公英對總皂苷的測定無干擾。

正交試驗最佳提取工藝為：液料比10∶1，提取2次，每次1.5 h，所得總皂苷質(zhì)量分數(shù)的平均值為2.90 mg·g-1。響應(yīng)面法得到加味三根湯的最佳提取條件：液料比8∶1，提取2次，每次2 h，所得的理論總皂苷質(zhì)量分數(shù)為3.21 mg· g-1，響應(yīng)面法的液料比(8倍量)小于的正交試驗法液料比(10倍量)，其提取時間(4 h)則大于響應(yīng)面法的加熱時間(3 h)，所以兩種方法生產(chǎn)耗能基本相同。兩種方法得到的結(jié)論也是基本一致的：提取次數(shù)對總皂苷含量影響顯著，各因素對總皂苷含量的影響順序為提取次數(shù)>液料比>提取時間，但是響應(yīng)面法提取的總皂苷含量較正交試驗法提高了10.7%，更適合加味三根湯提取工藝。

在正交試驗中，提取次數(shù)對總皂苷含量的影響差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提取時間、液料比則不顯著，但是在響應(yīng)面法中還發(fā)現(xiàn)提取次數(shù)和液料比存在較強的交互作用，對總皂苷含量的影響較大，因此這3種因素對總皂苷含量的影響不是簡單的線性關(guān)系。因此，兩種方法相比較，響應(yīng)面法能更好地解釋多因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，特別是因素之間存在交互作用的。在當前的藥材提取工藝研究中，正交試驗的應(yīng)用較多[15-18]，該方法得出的結(jié)果直觀易分析，但是它得到的優(yōu)選值，只能是試驗所用水平的某一種組合，具有局限性。響應(yīng)面法是將一系列的實驗數(shù)據(jù)用多項式進行擬合，得出回歸方程，然后將函數(shù)以圖形的方式表現(xiàn)出來，從而能直觀地分析出各個因素與響應(yīng)面之間的關(guān)系以及因素之間的交互關(guān)系。所以響應(yīng)面法用于多因素影響的提取工藝分析更為科學、合理。