珍珠梅中γ-羥基腈苷Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎、鎮(zhèn)痛活性研究△

魯文雪，趙瑩，孫亞楠，曲桂武*，吳長景

1.濱州醫(yī)學院 抗衰老研究所，山東 煙臺 264003；2.周口師范學院，河南 周口 466001

羥基氰苷是一類苷元中含有氰基的氧苷類化合物，根據(jù)氰基相對于氧苷鍵的位置，又將這類化合物分為α-羥基腈苷和γ-羥基腈苷兩類。其中α-羥基腈苷易被β-葡萄糖苷酶或稀酸催化水解，生成的α-羥基腈苷元很不穩(wěn)定，會繼續(xù)分解為醛(酮)和氫氰酸，而γ-羥基腈苷則不會發(fā)生這類反應(yīng)[1]。

Sutherlandin-5-cis-p-coumarate是從薔薇科珍珠梅屬植物珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun中分離得到的一個γ-羥基腈苷化合物，其化學結(jié)構(gòu)如圖1所示。我們曾報道過該化合物能顯著抑制LPS刺激的RAW 264.7細胞炎癥因子NO的釋放水平[2]。由于該化合物分子中的氰基屬γ-羥基腈結(jié)構(gòu)，難以被酶或酸催化水解[3]，因此具有良好的化學穩(wěn)定性。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎藥理活性與化學穩(wěn)定性特點，使其具有潛在的藥用研究價值。

圖1 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate化學結(jié)構(gòu)

關(guān)于Sutherlandin-5-cis-p-coumarate抗炎活性的進一步研究有待進行。本實驗通過對二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗、醋酸致小鼠腹腔毛細管通透性增加實驗、醋酸致小鼠扭體實驗和小鼠熱板實驗[4-8]，確認Sutherlandin-5-cis-p-coumarate腹腔注射時的抗炎、鎮(zhèn)痛活性，為其進一步的成藥性研究提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由濟南鵬悅實驗動物繁育有限公司提供，動物合格證號：SCXK(魯)20140007。

1.2 藥品與試劑

Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對照品(實驗室自制，無色針狀結(jié)晶，1H-NMR與13C-NMR光譜數(shù)據(jù)與文獻[2]相符)；珍珠梅采自青島市黃島區(qū)太行山小區(qū)院內(nèi)，經(jīng)濱州醫(yī)學院抗衰老研究所曲桂武副教授鑒定為薔薇科植物珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun的地上部位；層析硅膠(100～200目，黃?；瘜W試劑公司)；醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：160337)；阿司匹林(石藥集團，批號：018171287)；伊文思藍(中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司，批號：871225)；水為Milli-Q超純水。羧甲基纖維素鈉(規(guī)格：20 g·L-1水溶液，黏度為500～800 mPa·s)與其他試劑均為分析純，中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器

2545B型制備色譜儀(美國Waters)；YMC-Actus C18制備型反相色譜柱(50 mm×20 mm，5 μm，日本YMC)；Thermo Fisher UltiMate3000高效液相色譜儀(美國Thermo公司)；Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Phenomenex)；電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；UV-2600型紫外分光光度計(日本島津株式會社)；YLS-6B型智能熱板儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司)；KQ-50B超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Hei-VAP Precision旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph)。

2 方法

2.1 供試品制備

取珍珠梅藥材，粉碎后用乙醇回流提取。收集提取液，按參考文獻[2]所述方法依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，取乙酸乙酯萃取部位，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、反相制備色譜處理，即得無色針狀Sutherlandin-5-cis-p-coumarate結(jié)晶。

2.2 樣品溶液制備

分別精密稱取Sutherlandin-5-cis-p-coumarate及研磨成粉末的醋酸潑尼松和阿司匹林適量，加入5%的羧甲基纖維素鈉溶液，超聲混勻，制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0 mg·mL-1的Sutherlandin-5-cis-p-coumarate混懸液，質(zhì)量濃度為0.15 mg·mL-1的醋酸潑尼松混懸液，質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1的阿司匹林混懸液。

2.3 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

取健康SPF級昆明小鼠50只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機分成5組，分別為空白對照組(5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃組)，醋酸潑尼松組，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的高、中、低劑量組。每組每天灌胃給藥1次，每次0.4 mL，連續(xù)7 d，于末次給藥1 h后，在各組小鼠右耳正反面涂抹0.1 mL二甲苯致炎，左耳不做處理。30 min后脫頸椎處死小鼠，沿耳廓基線剪下左右兩只耳片，用8 mm直徑打孔器分別在同一部位打下圓耳片，立即精密稱質(zhì)量，并按公式(1)和(2)計算每只小鼠的耳廓腫脹度和腫脹抑制率[9-10]。

腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

(1)

腫脹抑制率=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%

(2)

2.4 對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

取健康SPF級昆明小鼠50只，雌雄各半，按2.3項下方法分組與給藥，并在末次給藥1 h后，給予各組每只小鼠尾靜脈注射0.5%的伊文思藍0.9%氯化鈉溶液0.2 mL，隨即腹腔注射0.7%的冰醋酸溶液0.2 mL，30 min后脫頸處死小鼠，腹腔注射5 mL 0.9%氯化鈉溶液，輕揉小鼠腹部，打開腹腔，收集腹腔洗液，3000 r·min-1離心10 min，取上清液，于590 nm波長下測其吸光度值(A)，按公式(3)計算滲出抑制率[11]。

(3)

2.5 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

取健康SPF級昆明小鼠50只，雌雄各半，按2.3項下方法分組與給藥(以阿司匹林為陽性對照)，并在末次給藥1 h后，每只腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2 mL，記錄每只小鼠在20 min內(nèi)的扭體次數(shù)，按公式(4)計算鎮(zhèn)痛率[12-13]。

鎮(zhèn)痛率=(空白對照組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/空白對照組扭體次數(shù)×100%

(4)

2.6 對熱板刺激引起小鼠疼痛反應(yīng)的影響

將智能熱板儀溫度調(diào)節(jié)至(55.0±0.5)℃，將小鼠置于其中，同時啟動電子計時器，以小鼠開始舔后足或出現(xiàn)跳躍現(xiàn)象所需的時間為痛閾值，共測2次，每次間隔30 min，取兩次結(jié)果的平均值作為該小鼠給藥前的正常痛閥值[14]。選取正常痛閥值在5～30 s的小鼠50只，雌雄各半，按2.3項下方法分組與給藥(以阿司匹林為陽性對照)，并于末次給藥后30、60、90 min，分別以熱板法測量各組小鼠的痛閾值，如60 s后仍無反應(yīng)，將小鼠取出，以免燙傷，其痛閾值以60 s計。

2.7 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

實驗結(jié)果如表1所示。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對二甲苯致小鼠耳廓腫脹具有抑制作用，高、中、低3個劑量的腫脹抑制率分別為72.42%、57.43%、27.70%，且高、中劑量組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，腫脹抑制率高于或接近陽性對照組，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate具有抗炎消腫作用。

表1 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。

3.2 對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

實驗結(jié)果如表2所示。與空白對照組比較，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3個劑量組的滲出抑制率分別為60.87%、69.57%、19.56%，且高、中劑量組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示高、中劑量的Sutherlandin-5-cis-p-coumarate具有抗炎作用。

表2 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

3.3 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

實驗結(jié)果如表3所示。與空白對照組比較，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3個劑量組的抑制率分別為63.05%、57.54%、35.81%，且高、中劑量組與空白對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，抑制率與陽性對照相近，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對醋酸刺激引起的小鼠致疼反應(yīng)有抑制作用。

表3 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3.4 對熱板刺激引起小鼠疼痛反應(yīng)的影響

實驗結(jié)果如表4所示。與空白對照組比較，Sutherlandin-5-cis-p-coumarate高、中、低3個劑量組在給藥30 min后的痛閥值明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對小鼠因熱板刺激引起的疼痛具有抑制作用。

4 討論

珍珠梅Sorbariasorbifolia(L.)A.Braun廣泛分布于云南、貴州、四川、甘肅、寧夏及東北，有活血祛瘀、消腫止痛的作用，主治跌打損傷、骨折、風濕痹痛；苦、寒，有毒，歸肝、腎經(jīng)[13]?，F(xiàn)有文獻主要報道了珍珠梅乙酸乙酯提取物的多種藥理活性[15-19]，但具體物質(zhì)基礎(chǔ)仍有待闡明。我們曾報道在珍珠梅中發(fā)現(xiàn)的氰苷化合物，能夠抑制LPS刺激的RAW 264.7細胞炎癥因子NO的釋放水平。其中的α-羥基腈苷可在酶或稀酸作用下水解產(chǎn)生氫氰酸，由此可以解釋珍珠梅具有的毒性；而以Sutherlandin-5-cis-p-coumarate為代表的γ-羥基腈苷，由于具有良好的化學穩(wěn)定性與藥理活性，則有望在珍珠梅的臨床應(yīng)用中扮演重要的角色。

本研究采用動物模型考察了Sutherlandin-5-cis-p-coumarate的抗炎鎮(zhèn)痛活性，并分別以醋酸潑尼松和阿司匹林為抗炎和鎮(zhèn)痛模型的陽性對照藥，所用劑量系根據(jù)人用劑量換算而來。所采用的4種模型，則是藥物抗炎、鎮(zhèn)痛活性研究的常用模型，其中二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型和醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加模型，均可產(chǎn)生局部血管擴張及毛細血管通透性增加等炎癥的典型特征；腹腔注射醋酸可增加腹腔液中的前列腺素等致痛物質(zhì)，從而使外周痛覺神經(jīng)敏化，使小鼠產(chǎn)生扭體反應(yīng)，而熱板法比化學刺激致小鼠扭體反應(yīng)更敏感，更能反映藥物的鎮(zhèn)痛活性。Sutherlandin-5-cis-p-coumarate經(jīng)灌胃給藥后，對二甲苯致小鼠耳廓腫脹和醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的增加，以及對因醋酸刺激和因熱板刺激引起的小鼠疼痛反應(yīng)均具有不同程度的抑制作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，預(yù)示Sutherlandin-5-cis-p-coumarate在抗炎鎮(zhèn)痛藥物研究領(lǐng)域具有潛在的價值，但具體的作用機制還有待于進一步研究。

表4 Sutherlandin-5-cis-p-coumarate對熱板刺激引起小鼠疼痛反應(yīng)的影響