基于LC-MS聯(lián)用的杜仲主要化學(xué)成分定性及定量分析△

雒曉梅，宿美鳳，2，常曉燕，王小明，李壯壯，王衛(wèi)華，孫桂波，石鉞*

1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.清華大學(xué) 藥學(xué)技術(shù)中心，北京 100084

杜仲EucommiaulmoidesOliv.為杜仲科杜仲屬落葉喬木，是我國特有的第三世紀(jì)孑遺植物。杜仲干燥樹皮自古以來以名貴滋補(bǔ)中藥材而著稱，用藥歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，杜仲味辛性平，主治腰膝痛、補(bǔ)中、益精氣、堅(jiān)筋骨、強(qiáng)志，除陰下癢濕，小便馀瀝[1]。歷版《中華人民共和國藥典》均有將杜仲收錄在冊[2]，現(xiàn)代研究表明杜仲樹皮主要化學(xué)成分包括木脂素、環(huán)烯醚萜、黃酮、苯丙素、酚酸、甾醇及三萜、多糖、抗菌蛋白等，具有降壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌抗病毒、保肝護(hù)腎等藥理活性[3-6]。目前國內(nèi)外學(xué)者對杜仲的研究集中在藥理活性[7]、成分分析[8]、質(zhì)量評價(jià)等[9-11]方面。本實(shí)驗(yàn)在前期的研究基礎(chǔ)上，首次采用四級桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-QE)對杜仲70%乙醇水提取物的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，采用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)三重四級桿質(zhì)譜儀對其中7個(gè)主要成分(松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、車葉草苷)進(jìn)行定量分析，以期完善杜仲臨床藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，對其進(jìn)一步合理開發(fā)用藥及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000超高效液相(美國戴安公司)串聯(lián)Thermo Q ExactiveTMPlus OrbitrapTM高分辨質(zhì)譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)，Agilent1290-QQQ6460液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，Mettler Toledo AB135-S型分析天平(十萬分之一，瑞士)，KQ-250DE超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 藥材與試劑

杜仲(批號：DC1211)購于北京華邈藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京師范大學(xué)資源學(xué)院杜樹山教授鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，藥品標(biāo)本現(xiàn)保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所植物化學(xué)研究室。對照品均購于成都克洛瑪生物科技有限公司，包括松脂醇二葡萄糖苷(批號：CHB170307)、松脂醇單葡萄糖苷(批號：CHB161227)、丁香脂素二葡萄糖苷(批號：CHB170706)、桃葉珊瑚苷(批號：CHB161103)、京尼平苷(批號：CHB171130)、京尼平苷酸(批號：CHB161101)、車葉草苷(批號：CHB161228)、山柰酚(批號：CHB170224)、黃芩苷(批號：CHB170720)、蘆丁(批號：CHB170303)、槲皮素(批號：CHB171229)、綠原酸(批號：CHB170713)、原兒茶酸(批號：CHB170822)、阿魏酸(批號：CHB160913)、咖啡酸(批號：CHB160907)，上述對照品HPLC法測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)購于Honeywell Burdick&Jackson公司。甲酸(色譜級)、氨水(色譜級)購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司，去離子水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

2 定性分析方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 供試品溶液制備 將干燥的杜仲樹皮剪碎稱取適量，加入8倍量70%乙醇水熱回流提取3次，每次1.5 h，濾過得提取藥液，合并3次濾液，減壓濃縮得流浸膏(得膏率為25%)。稱取上述浸膏1.202 0 g溶于50%甲醇中配成終質(zhì)量濃度0.5 mg·mL-1(生藥質(zhì)量濃度2 mg·mL-1)的供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液配制 分別精密稱取松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、車葉草苷、山柰酚、黃芩苷、蘆丁、綠原酸、原兒茶酸、阿魏酸，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品貯備液，取適量對照品貯備液混合后，得對照品混合液。

2.2 液質(zhì)條件

2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸-水；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；自動進(jìn)樣器溫度：10 ℃。梯度洗脫條件：0～2.0 min，5%～5%A；2.0～42.0 min，5%～50% A；42.0～55.0 min，50%～50%A；55.0～55.1 min，50%～5%A；55.1～60.0 min，5%～5%A。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，負(fù)離子檢測模式，噴霧電壓：-2800 V；毛細(xì)管溫度：320 ℃；保護(hù)氣體流速：35 L·min-1；輔助氣體流速：10 L·min-1；掃描模式：Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，掃描范圍：m/z100～1500，階梯碰撞能量：20、40、60 V。

2.3 杜仲化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

根據(jù)Dictionary of Natural Product數(shù)據(jù)庫(http：//www.chemnetbase.com)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以及文獻(xiàn)檢索所提供的杜仲樹皮的化學(xué)成分，結(jié)合Chemspider、Pubchem、Chembook數(shù)據(jù)庫的化合物信息，構(gòu)建杜仲的化學(xué)成分信息庫，包括化合物的名稱、分子式、分子量和CAS號等。

2.4 數(shù)據(jù)處理

將UPLC-QE所采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Thermo Compound Discover2.0(CD)分析軟件進(jìn)行初步計(jì)算，CD軟件可充分利用高保真的Orbitrap數(shù)據(jù)來準(zhǔn)確鑒定復(fù)雜基質(zhì)中的化合物，通過定制相應(yīng)的工作流程，結(jié)合了多種識別技術(shù)，包括與mzCloud庫、mzVault庫、Chemspider庫進(jìn)行碎片及分子量匹配，從而初步篩選得出杜仲提取物中可能存在的化合物。此外，借助Thermo Xcalibur 2.2分析軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析和處理，根據(jù)高分辨質(zhì)譜信息對其分子式進(jìn)行推導(dǎo)，偏差不得大于5×10-6，對照參考文獻(xiàn)[12-13]、各種在線數(shù)據(jù)庫，推導(dǎo)可能的裂解碎片，

最終確定杜仲提取物中存在的化合物。

2.5 定性分析結(jié)果

按2.2項(xiàng)下條件對杜仲提取物進(jìn)行分析，負(fù)離子模式下的總離子流色譜圖見圖1。通過與對照品比對及數(shù)據(jù)解析共確定98個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，包括木脂素類38個(gè)，環(huán)烯醚萜類13個(gè)，黃酮類9個(gè)，苯丙素類15個(gè)，酚類7個(gè)，三萜類、甾醇、小分子酸及其他化合物共16個(gè)。定性的結(jié)果如表1所示。

圖1 杜仲70%乙醇水提取物的總離子流圖

表1 杜仲70%乙醇水提取物中主要化合物

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

注：*表示化合物已與對照品比對確定。

2.5.1 木脂素類成分裂解特征 從杜仲提取液中共鑒定出38個(gè)木脂素類化合物[14-20]。該類化合物結(jié)構(gòu)母核有5種：木脂素?zé)N基上不同位置氧取代基縮合形成四氫呋喃型單環(huán)氧木脂素(化合物23、39、40、55)；單環(huán)氧木脂素中脂肪烴鏈上羥基縮合形成雙駢四氫呋喃環(huán)的雙環(huán)氧木脂素(化合物38、44、47、50、51、52、61、62、63、68、69、70、71、78)及倍半木脂素(化合物64、76、77、79、81、82、84、85、86、87、89、93、94)。由1分子苯丙烯的側(cè)鏈與另一分子苯丙烯的苯核聚合或通過氧鍵而聚合形成新木脂素(化合物36、41、46、57、65、67)。兩分子的苯丙烯側(cè)鏈聚合形成芳基四氫萘為基本骨架的環(huán)木脂素類(化合物43)。倍半木脂素在二級質(zhì)譜中醚鍵斷裂后，其剩余骨架的碎裂與雙環(huán)氧木脂素、單環(huán)氧木脂素相似，多為先丟失糖基、CH3、CH2O、CH3OH、OCH3，接著發(fā)生四氫呋喃環(huán)的裂解，丟失1個(gè)或是連續(xù)丟失2個(gè)CH2O，最終形成特征離子m/z151。以松脂醇二葡萄糖苷的質(zhì)譜裂解為例，如圖2所示，準(zhǔn)分子離子峰m/z681連續(xù)丟失糖基形成m/z519、357，前體碎片m/z357中的兩個(gè)四氫呋喃環(huán)連續(xù)丟失2個(gè)CH2O，最終形成m/z151的碎片離子。

2.5.2 環(huán)烯醚萜類的裂解特征 從杜仲提取液中共鑒定出13個(gè)環(huán)烯醚萜類化合物(化合物3、4、5、9、14、17、18、21、30、31、35、45、53)，該類化合物的基本母核是含有半縮醛醇羥基的環(huán)烯醚萜醇類，多以苷類的形式存在。常見易丟失母核上的功能基團(tuán)葡萄糖、葡萄糖殘基、H2O、CO2、CH3OH、CH3COOH等中性碎片[21-24]，形成[M-H-Glu]-、[M-H-Glc]-、[M-H-Glc-H2O]-、[M-H-Glc-CO2]-、[M-H-Glc-H2O-CO2]-等碎片離子。此外環(huán)戊烯型的環(huán)烯醚萜由1個(gè)二氫吡喃環(huán)順式連接五元環(huán)，由于母核結(jié)構(gòu)上半縮醛結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化，可能造成二氫吡喃環(huán)的斷裂[25]。以京尼平苷酸的質(zhì)譜裂解為例，如圖3所示，京尼平苷酸的準(zhǔn)分子離子峰m/z373丟失1分子Glc、H2O、CO2等形成m/z211、193、167、149的碎片峰，京尼平苷酸母核結(jié)構(gòu)含有半縮醛結(jié)構(gòu)，易形成2個(gè)醛結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)體，導(dǎo)致母環(huán)斷裂。m/z123碎片離子的形成源于母環(huán)裂解后γH的重排。

2.5.3 黃酮類的裂解特征 從杜仲提取液中共鑒定出9個(gè)黃酮化合物(化合物54、56、59、83、88、90、95、96、97)，其中5個(gè)黃酮醇類、4個(gè)黃酮類。由于黃酮類及黃酮醇類的化合物質(zhì)譜裂解相似，故以蘆丁的質(zhì)譜裂解為例進(jìn)行分析[26-28]，如圖4所示，蘆丁為槲皮素的蕓香糖苷，在一級質(zhì)譜圖中可見準(zhǔn)分子離子峰m/z609，在丟失蕓香糖中性碎片后形成苷元碎片m/z301，苷元碎片發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生碎片m/z151，此外，m/z301丟失1分子H2O、CO產(chǎn)生碎片離子m/z255，該碎片離子經(jīng)重排后易丟失中性分子CO產(chǎn)生m/z227的碎片離子。

圖2 ESI負(fù)離子模式下松脂醇二葡萄糖苷可能的裂解途徑

圖3 ESI負(fù)離子模式下，京尼平苷酸可能的裂解途徑

圖4 ESI負(fù)離子模式下蘆丁可能的裂解途徑

2.5.4 苯丙素類的裂解特征 在杜仲提取物中鑒定出15個(gè)苯丙素類化合物(化合物7、15、16、20、22、24、28、29、34、42、49、60、66、75、92)。已鑒定的多數(shù)苯丙素的結(jié)構(gòu)與綠原酸相似或是綠原酸的某個(gè)片段，故以綠原酸為例說明已解析的苯丙素可能的裂解規(guī)律[29-30]。綠原酸是咖啡酸與奎寧酸形成的酯。在一級質(zhì)譜中可見其準(zhǔn)分子峰m/z353，綠原酸的酯鍵斷裂后形成碎片m/z191、179，奎寧酸片段m/z191在丟失1分子H2O后形成碎片離子m/z173，咖啡酸片段m/z179在丟失一分子CO2后形成碎片m/z135。

3 定量分析方法與結(jié)果

3.1 溶液的配制

3.1.1 供試品溶液配制 精密稱取2.1.1項(xiàng)下的流浸膏，以水為稀釋液，稀釋不同倍數(shù)后作為供試品溶液。

3.1.2 對照品溶液配制 分別精密稱取松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、車葉草苷，甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品貯備液，取適量對照品貯備液混合后，得對照品混合液。

3.2 液質(zhì)條件

3.2.1 色譜條件 色譜柱Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，流動相A：體積分?jǐn)?shù)為0.01%的氨水，流動相B：體積分?jǐn)?shù)為0.01%氨水的乙腈甲醇(1∶1)，流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脫條件：0～3 min，100%A；3～5 min，100%～90%A；5～8 min，90%～90%A；8～11 min，90%～80%A；

11～13 min，80%～20%A；13～15 min，20%～0%A；15～16 min，0%A；16～16.1 min，0%～100%A；16.1～20 min，100%A。

3.2.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源，負(fù)離子檢測模式。Sheath Gas Temp為300 ℃，Sheath Gas Flow流速為11 L·min-1，Gas Temp為325 ℃，Gas Flow為8 L·min-1。Capillary電壓為4000 V(-)，Nebulizing Gas為45 psi(1psi=6.895 kPa)，Nozzle Voltage電壓為500 V(-)。掃描模式為多反應(yīng)檢測模式(MRM)，7種成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2，色譜圖見圖5。

表2 杜仲提取物中7個(gè)主要成分的質(zhì)譜測定參數(shù)

注：A.對照品；B.杜仲提取物樣品；1.車葉草苷；2.桃葉珊瑚苷；3.京尼平苷；4.京尼平苷酸；5.松脂醇單葡萄糖苷；6.松脂醇二葡萄糖苷；7.丁香脂素葡萄糖苷。圖5 杜仲提取物中7個(gè)主要成分的離子流圖

3.3 定量方法學(xué)考察

3.3.1 線性關(guān)系考察 取3.1.2項(xiàng)下的各對照品母液以水進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，得到系列濃度的混合對照品工作液。依3.2項(xiàng)下的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析。以各待測組分的質(zhì)量濃度(X，μg·L-1)分別對相應(yīng)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各成分均有良好的線性關(guān)系。將線性范圍的最低質(zhì)量濃度繼續(xù)稀釋，進(jìn)樣分析，以信噪比S/N=10的進(jìn)樣濃度為定量下限(LOQ)，以信噪比S/N=3時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢測限(LOD)。結(jié)果見表3。

3.3.2 精密度試驗(yàn) 取3.1.2項(xiàng)下對照品混合溶液，按3.2項(xiàng)下的色譜質(zhì)譜條件測定。連續(xù)進(jìn)樣6次，7個(gè)待測化合物峰面積的RSD分別為2.75%、2.25%、2.17%、2.11%、2.21%、1.29%、3.42%，結(jié)果見表3，RSD均小于5.0%，表明該儀器及方法的精密度良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3.1.2項(xiàng)下對照品混合溶液，在3.2項(xiàng)液質(zhì)條件下，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品峰面積計(jì)算各成分的含量和RSD，結(jié)果顯示各成分含量的RSD分別為4.12%、1.90%、2.71%、2.62%、2.96%、5.01%、4.96%，RSD均小于6%，表明各被測成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按3.1.1項(xiàng)下方法制備杜仲提取物的供試品溶液，在3.2項(xiàng)液質(zhì)條件下，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品峰面積計(jì)算7個(gè)成分的含量及RSD，得出各成分質(zhì)量濃度平均值分別為28.42、252.57、100.55、351.57、174.40、225.22、160.89 μg·L-1，RSD分別為1.95%、2.93%、4.32%、1.11%、2.57%、3.15%、3.06%，RSD均小于5%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱定同一批已知含量的杜仲提取物約1 mg，平行6份，置于量瓶中，分別加入各對照品適量，按3.2.1項(xiàng)下方法制備供試品，進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率及其RSD，結(jié)果見表4。各成分平均回收率在90%～110%，RSD均小于5%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3.4 樣品含量測定

精密稱量杜仲提取物，平行6份，按3.1.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，在3.2項(xiàng)液質(zhì)條件下進(jìn)樣分析，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品峰面積計(jì)算各成分的含量，結(jié)果每克杜仲生藥含車葉草苷2.84 μg、桃葉珊瑚苷101.03 μg、京尼平苷167.59 μg、京尼平苷酸585.95 μg、松脂醇單葡萄糖苷290.67 μg、松脂醇二葡萄糖苷1 638.50 μg、丁香脂素二葡萄糖苷268.15 μg。

4 討論

在實(shí)驗(yàn)中，定性色譜條件考察了包括乙腈-0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸水的不同配比和梯度洗脫，最終確定乙腈-0.1%甲酸水色譜峰的分離度、峰形及質(zhì)譜的離子化效率更好；定量色譜條件考察中發(fā)現(xiàn)加入0.01%氨水后，色譜峰的峰型及離子化更佳。同時(shí)考察了Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱以及Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱的差異，通過結(jié)果對比最終選擇了0.01%氨水-0.01%(V/V)氨水的乙腈-甲醇(1∶1)系統(tǒng)以及Waters HSS T3柱。質(zhì)譜條件考察了UPLC-QE高分辨質(zhì)譜正、負(fù)離子檢測模式，得出負(fù)離子模式下的各類化合物的離子化更佳、信息更豐富。結(jié)合杜仲中化合物的類型，選擇負(fù)離子檢測模式為成分分析及含量測定的方法。

表3 杜仲提取物中7個(gè)主要成分的回歸方程、線性范圍、LOD、LOQ

表4 杜仲提取物中7個(gè)主要成分的回收率試驗(yàn)結(jié)果

本研究采用UPLC-QE技術(shù)快速、全面分析杜仲中的化學(xué)成分，共鑒定出98個(gè)化合物，包括木脂素類38個(gè)，環(huán)烯醚萜類13個(gè)，黃酮類9個(gè)，苯丙素類15個(gè)，酚類7個(gè)，其余化合物16個(gè)。杜仲在含有豐富化合物基礎(chǔ)上，其藥理活性與臨床應(yīng)用也比較廣泛[1-3]，目前《中華人民共和國藥典》2015版(一部)中杜仲項(xiàng)下僅對松脂醇二葡萄糖苷進(jìn)行測定，因此本研究隨后選擇杜仲中含量豐富且藥理活性明確的松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷、桃葉珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、車葉草苷共7種化合物進(jìn)行含量測定。對杜仲中上述7種主要活性成分進(jìn)行含量測定的方法學(xué)考察，確定含量測定方法，為綜合評價(jià)杜仲的藥用質(zhì)量提供重要參考。