粗葉泥炭蘚原絲體增殖條件篩選研究

尹麗娟 （上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海市徐匯區(qū) 200232；上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海市徐匯區(qū) 200232）

由于泥炭富含有機質(zhì)和腐殖酸，既可直接作為栽培介質(zhì)[1]，也可用作改良土壤的肥料[2]，故園藝產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展也成就了泥炭產(chǎn)業(yè)。但隨著泥炭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，泥炭地被過度開采，這不僅對植被分布、生態(tài)多樣性、自然碳匯功能造成嚴(yán)重破壞[3]，還導(dǎo)致我國由泥炭出口國逐漸成為進口國[4]。因此，亟需找到泥炭的替代品，以實現(xiàn)對泥炭資源的可持續(xù)利用，也可確保農(nóng)業(yè)和園藝產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展。泥炭蘚（Sphagnumsp.）又稱水苔，是泥炭蘚屬植物的統(tǒng)稱。德國等園藝發(fā)達(dá)國家的研究表明，泥炭蘚可替代泥炭作為生長基質(zhì)[5]，并已成功應(yīng)用于杜鵑、歐石楠等植物的栽培中；泥炭蘚由于吸水性極強[6-8]，還可用于食品保鮮[9]、提高植物嫁接成活率[10]等方面。

苔蘚植物繁殖可分為有性生殖和無性生殖；成熟泥炭蘚孢蒴中的孢子數(shù)量為6萬～8萬[11]，在人工培養(yǎng)下其萌發(fā)率可達(dá)60%[12]，繁殖系數(shù)極高；但在自然條件下，由于泥炭蘚雌雄異株和受精過程過分依賴水分的特性，導(dǎo)致其有性生殖“衰退”[13]。因此，人為提高孢子體的利用率是泥炭蘚快速繁殖的有效途徑。有研究表明，原絲體階段是泥炭蘚有性生殖的必經(jīng)階段，且原絲體可獨立生活，在苔蘚生活史中占有重要地位；關(guān)于泥炭蘚原絲體的報道大多集中在原絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)學(xué)方面的研究[13-16]，在泥炭蘚的組織培養(yǎng)方面，僅有研究報道了三種泥炭蘚原絲體在不同氮磷濃度、溫度、光照條件下的發(fā)育狀況[17]，且沒有進行生長量化方面的描述，無法得知泥炭蘚原絲體最佳生長條件；李大華[18]和姜山[19]等人雖研究了培養(yǎng)基種類、糖類、酒石酸銨、微量元素對不同種類泥炭蘚莖尖生長的影響，但對泥炭蘚原絲體快速增殖的相關(guān)研究還未見報道。因此，本研究以粗葉泥炭蘚（Sphagnum squarrosum）無菌原絲體為材料，對培養(yǎng)基、pH、碳源和生長調(diào)節(jié)劑種類及濃度對其生長量的影響進行研究，以期找出泥炭蘚原絲體快速增殖的途徑，從而提高泥炭蘚的園藝產(chǎn)量，為泥炭蘚在園藝產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將相關(guān)試驗結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

帶有孢蒴的粗葉泥炭蘚植株采集于新疆喀納斯，選擇飽滿、帶柄的成熟孢蒴，在自來水下沖洗4 h后，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺上，用75%酒精消毒30 s、無菌水清洗3 次，然后用0.5%次氯酸鈉（NaClO）消毒1 min，再用無菌水清洗干凈后，擠破孢蒴，接種在knop 液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d 待用。

1.2 試驗設(shè)計

培養(yǎng)基篩選試驗：設(shè)培養(yǎng)基分別為BCD、Beneck（簡稱BM）、Knop（簡稱KM）、MS、1/2MS、1/4MS，以清水為對照。

培養(yǎng)基pH篩選試驗：以Beneck為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH 分別設(shè)置為4、5、6、7、8。

碳源篩選試驗：以Beneck 為基本培養(yǎng)基，添加濃度分別為0、5、10、20、40 g/L 的葡萄糖或蔗糖，以不加糖為對照。

生長調(diào)節(jié)劑篩選試驗：以Beneck為基本培養(yǎng)基，添濃度分別為 0.1、1、10 μmol/L 的 IBA 和 6-BA，以不添加任何生長調(diào)節(jié)劑為對照。

過濾無菌泥炭蘚原絲體，并用無菌水反復(fù)沖洗后，在18 000 r/min 條件下打碎，制成均勻的懸浮液，加入到以上培養(yǎng)基中，培養(yǎng)分為液體懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為溫度25 ℃、光周期16 h/8 h。培養(yǎng)20 d 后，稱量原絲體生長量，計算增殖倍數(shù)。

計算公式：增殖倍數(shù)=（處理原絲體干重-對照原絲體干重）/對照原絲體干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Origin 7.5 和DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)14.1進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選

由圖1可知，粗葉泥炭蘚在兩種培養(yǎng)方式下，各培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)均有差異。其中，Beneck 培養(yǎng)基和Knop 培養(yǎng)基最有利于粗葉泥炭蘚原絲體的增殖；不同濃度的MS培養(yǎng)基上粗葉泥炭蘚原絲體增殖效果差異不顯著，但濃度越高繁殖越慢。說明粗葉泥炭蘚原絲體適合在配方簡單、鹽度較低的培養(yǎng)基中生長，故以下試驗均以Beneck 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)基種類對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.2 pH篩選

培養(yǎng)基的pH 決定了泥炭蘚原絲體生長的酸堿環(huán)境。由圖2可知，在兩種培養(yǎng)方式下，均以培養(yǎng)基pH 為5～6時，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖效果較好；培養(yǎng)基pH 為4時，兩種培養(yǎng)方式的粗葉泥炭蘚原絲體的增殖效果有所差異，以采用液體懸浮培養(yǎng)的增殖效果較好，且采用固體培養(yǎng)的泥增蘚原絲體的殖效果顯著低于培養(yǎng)基pH為5～6時。以上結(jié)果表明，弱酸環(huán)境適宜泥炭蘚原絲體的增殖，而中性至弱堿性環(huán)境不利于泥炭蘚原絲體的增殖，且pH 越高，其長勢越差。

圖2 不同pH對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.3 碳源篩選

由圖3可知，粗葉泥炭蘚在無碳源的培養(yǎng)基中可以生長，但加入碳源后，其生長勢明顯增強。在兩種培養(yǎng)方式下，蔗糖對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用均非常明顯，而葡萄糖對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用以采用固體培養(yǎng)為優(yōu)；采用液體懸浮培養(yǎng)時，蔗糖和葡萄糖的最佳濃度為5～10 g/L，采用固體培養(yǎng)時，蔗糖和葡萄糖的最佳濃度為10～20 g/L，這說明采用液體懸浮培養(yǎng)粗葉泥炭蘚原絲體對糖的敏感程度更高。以上結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加中低濃度碳源可促進泥炭蘚原絲體的增殖，但隨著碳源濃度的升高，對增殖的促進作用逐漸降低。

此外，試驗中還發(fā)現(xiàn)，在不同碳源的固體培養(yǎng)基上，有少量泥炭蘚配子體分化現(xiàn)象出現(xiàn)。

圖3 碳源對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.4 生長調(diào)節(jié)劑篩選

由圖4可知，兩種生長調(diào)節(jié)劑均對粗葉泥炭蘚原絲體的增殖有一定影響，且以采用液體懸浮培養(yǎng)的增殖效果優(yōu)于采用固體培養(yǎng)。采用液體懸浮培養(yǎng)時，添加IBA 對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用不明顯，且高濃度的IBA 會抑制粗葉泥炭蘚原絲體的增殖；采用固體培養(yǎng)時，以低濃度（0.1 μmol/L）的IBA 對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用較好。在兩種培養(yǎng)方式下，添加6-BA均有利于促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，且以低濃度的促進作用更為明顯。

圖4 激素對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響

2.5 培養(yǎng)方式篩選

由以上結(jié)果可知，在兩種培養(yǎng)方式的不同試驗條件下，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖存在差異。經(jīng)相關(guān)性分析，液體懸浮培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的粗葉泥炭蘚原絲體的增殖結(jié)果呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.771**（n=31，R=0.449），這說明培養(yǎng)方式對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的影響不大，培養(yǎng)方式并不是粗葉泥炭蘚原絲體的增殖結(jié)果差異的主要來源，而培養(yǎng)基的種類、pH 及添加物才是結(jié)果差異的原因所在。

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖生長受多個因素的影響，在無碳源和無生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，粗葉泥炭蘚原絲體也可以生長，但增殖效果不佳，在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用意義不大；而在培養(yǎng)基中加入碳源和生長調(diào)節(jié)劑或改變pH后，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖效果有顯著變化，這有助于提高泥炭蘚的園藝產(chǎn)量。在本試驗條件下，低鹽度的Beneck 和Knop 培養(yǎng)基較為適宜粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，且培養(yǎng)基的最佳pH 為5～6；碳源是提高粗葉泥炭蘚原絲體增殖效果的關(guān)鍵因子，其中，蔗糖較葡萄糖更有利于促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，且以低濃度蔗糖的促進作用更為顯著；高濃度IBA和6-BA 均會抑制粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，低濃度的6-BA 則能促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖。

在培養(yǎng)基篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，苔蘚培養(yǎng)常用的BCD 培養(yǎng)基及不同濃度的MS 培養(yǎng)基均不適宜用于粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，這與前人的研究結(jié)果一致。例如，李大華[20]在多紋泥炭蘚莖尖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，采用MS 培養(yǎng)基不利于其萌發(fā)，以采用Beneck 和Knop培養(yǎng)基的多紋泥炭蘚萌發(fā)株數(shù)最多；付素靜[21]和于傳梅[22]等發(fā)現(xiàn)，尖葉匐燈蘚和短月蘚均以在Beneck 和Knop 兩種培養(yǎng)基上的增殖系數(shù)最大，而在MS 培養(yǎng)基上則生長較差，甚至變黃。由此可知，多數(shù)苔蘚植物在高鹽度的培養(yǎng)基上緩慢甚至受到抑制，而在相對簡單的培養(yǎng)基上生長良好。

在培養(yǎng)基pH篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，粗葉泥炭蘚原絲體在pH 較低的培養(yǎng)基上增殖效果較好，以pH 5～6 較為適宜，隨著培養(yǎng)基pH 的升高，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖逐漸減少，甚至停止，這與泥炭蘚人工培養(yǎng)的試驗結(jié)果一致。例如，泥炭蘚配子體在pH為6.0時生長速度最快[23]，說明泥炭蘚喜偏酸性環(huán)境，這也與泥炭蘚自然生境為偏酸性土壤相吻合。

在碳源篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，添加碳源能極大地促進粗葉泥炭蘚原絲體的增殖，采用固體培養(yǎng)的最佳碳源濃度為10～20 g/L，較采用液體懸浮培養(yǎng)高，推測是由于液體懸浮培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)基與粗葉泥炭蘚原絲體的接觸更加緊密，從而對糖濃度更加敏感所致，這也與前人的研究結(jié)果相一致。例如，姜山[24]發(fā)現(xiàn)糖是泥炭蘚生長最主要的因子，且以培養(yǎng)基中添加5 g/L 葡萄糖時其生長最佳；李大華[18]在三種泥炭蘚配子體固體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加20～25 g/L 蔗糖是其生長的最佳條件。同時，本試驗在加入碳源的固體培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)了粗葉泥炭蘚的配子體，經(jīng)分析，根據(jù)泥炭蘚原絲體的生長規(guī)律，第20天左右為葉狀原絲體階段[25]，接著會逐漸分生為芽體，即配子體的初始形態(tài)，這與梁書豐[26]的研究結(jié)果一致，他在真蘚培養(yǎng)過程中也發(fā)現(xiàn)，固體培養(yǎng)更有利于真蘚原絲體的分化。

生長素主要促進細(xì)胞伸長，而細(xì)胞分裂素主要促進細(xì)胞分裂和擴大[27]。在生長調(diào)節(jié)劑篩選試驗中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素6-BA 對粗葉泥炭蘚原絲體增殖的促進作用大于生長素IBA，由此可以判斷，粗葉泥炭蘚原絲體的增殖方式偏向于細(xì)胞橫向分裂及分支，而不是縱向伸長。同時，在兩種培養(yǎng)方式下，粗葉泥炭蘚原絲體采用液體懸浮培養(yǎng)的激素響應(yīng)濃度也低于采用固體培養(yǎng)，推測這也是由于液體懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基與粗葉泥炭蘚原絲體的接觸面積較固體培養(yǎng)的大而引起。