泛素基因沉默對TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子表達的影響

劉超英　董骎　高洪　嚴玉霖　富國文　單春蘭

摘要：為了探討泛素（ubiquitin，簡稱Ub）對TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子表達的影響，通過脂質(zhì)體將短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬小腸上皮細胞，使其泛素基因沉默，于轉(zhuǎn)染后6、12、24、48 h收集細胞及其上清。應用熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子TLR4、NF-κB、MyD88、IκB-α的mRNA表達水平，應用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測NF-κB、IκB-α及炎性因子TNF-α、IL-1含量的變化。結(jié)果顯示，shRNA質(zhì)粒有效地抑制了泛素基因的表達，轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒后，TLR4/NF-κB信號通路中TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α的mRNA表達量及NF-κB、IκB-α、TNF-α和IL-1含量均普遍呈下降的趨勢，說明泛素在炎性因子的釋放中起著至關(guān)重要的作用，泛素基因的沉默能夠抑制該通路的活化。

關(guān)鍵詞：泛素;基因沉默;信號通路;炎性因子

中圖分類號： S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0037-04

泛素-蛋白酶體途徑是一種廣泛存在于真核細胞中的非常重要的、依賴于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的蛋白質(zhì)降解途徑，可以從多個環(huán)節(jié)參與調(diào)控NF-κB信號通路[1-3]。泛素（ubiquitin，簡稱Ub）作為該途徑的重要組成部分，可以降解TLR4/NF-κB信號通路中的IκB，使NF-κB游離到細胞核內(nèi)參與炎性因子的合成，從而誘發(fā)炎癥反應[4-6]。當該途徑受到抑制時，會導致活性NF-κB的產(chǎn)生量減少，抗凋亡蛋白的水平隨之降低，使細胞出現(xiàn)凋亡[7]。

短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，簡稱shRNAs）是能夠形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的非編碼小RNA分子，因其具有特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在哺乳動物細胞中可以長期甚至穩(wěn)定地發(fā)揮RNA干擾作用，而不引起非特異性反應。因此，目前shRNA介導的RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成為研究哺乳動物細胞內(nèi)外基因功能強有力的工具[8-10]。為了研究泛素基因?qū)LR4/NF-κB信號通路的作用，本研究利用shRNA干擾技術(shù)對豬小腸上皮細胞的泛素基因進行沉默，并對TLR4/NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子的表達情況進行檢測，不僅可以為基因沉默的相關(guān)研究提供理論依據(jù)，還可以為從蛋白降解角度尋找治療炎癥類疾病的新思路奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

豬小腸上皮細胞（IPEC-J2），購自廣州吉尼歐生物有限公司;焦碳酸二乙酯（DEPC）、2×Easy Taq PCR Super Mix，購自北京百泰克生物有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑，購自Lifetechnologies公司;胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶溶液[025% 胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）]，購自Gibico公司;DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Hyclone公司。本試驗于云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院動物病理實驗室完成。

1.2試驗方法

1.2.1豬小腸上皮細胞的培養(yǎng)于37 ℃水浴，使IPEC-J2盡量在1 min內(nèi)完全融化，于4 000 r/min離心5 min，加入 1 mL DMEM培養(yǎng)液將底部細胞吹打均勻后，注入含有6 mL DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，輕緩搖晃使細胞均勻分布，然后置于37 ℃、5% CO2的溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2shRNA質(zhì)粒的設計及構(gòu)建根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站中的豬泛素基因的核苷酸序列，設計針對豬泛素基因保守區(qū)的shRNA序列UBC-sus-263（5′-GAGAACGTCAAGGCGAAGATC-3′），并設計陰性對照 UBC-shNC（5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′），質(zhì)粒載體為U6/GFP/Neo，帶綠色熒光標記，由上海吉瑪制藥公司合成。將質(zhì)粒DNA溶液于-20 ℃保存，對應的甘油菌液于 -80 ℃ 保存。

1.2.3泛素基因沉默在六孔板中培養(yǎng)IPEC-J2細胞，當匯合度達到80%左右時將培養(yǎng)液換為2 mL無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分為空白細胞對照組、shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6、12、24、48 h時收集細胞及其上清。

1.2.4引物設計本試驗選用β-actin作為內(nèi)參基因，在NCBI網(wǎng)站中查找公開發(fā)表的β-actin、TLR4、NF-κB、MyD88和IκB-α基因序列，遵循實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）的引物設計原則，利用Primer 6.0軟件設計引物，并由深圳華大基因股份有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.2.5Real-Time PCR提取細胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄說明書于冰上配制反應液，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后按下列組分配制熒光定量PCR反應液：12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RnaseH Plus）（2×），各0.7 μL PCR上下游引物（10 μmol/L），2.0 μL模板，9.1 μL dH2O，將上述反應液加入0.2 mL八聯(lián)排管中混勻，離心，在Bio-Rad Real-Time PCR儀上進行反應，反應程序設置如下：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，Tm 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán);溶解曲線55 ℃ 30 s，81個循環(huán)。結(jié)束后保存數(shù)據(jù)，并計算各指標的mRNA相對表達量。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測采集不同時期各處理組的細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測IκB-α、NF-κB 及炎性因子 IL-1、TNF-α的含量。

1.2.7數(shù)據(jù)處理本試驗中的所有數(shù)據(jù)均用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以平均值±標準差（x[TX-*5]±s）表示，用單因素方差分析比較各組均值的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒后IPEC-J2細胞中泛素基因的表達情況

根據(jù)24、48 h的反應循環(huán)數(shù)（CT值），計算shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2細胞后Ub基因的mRNA相對表達量。如圖1所示，UBC-sus-263的shRNA質(zhì)粒對泛素基因的沉默效果較好，在2個時間點中，其表達量均僅為空白細胞組的2%，表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。

2.2IPEC-J2細胞中TLR4、NF-κB、IκB-α 及MyD88的mRNA表達量

由圖2-A可以看出，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細胞內(nèi)的TLR4表達量明顯降低，相較于對照組顯示出極顯著差異，在24 h時降至最低值。而空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的TLR4表達量較空白細胞組略微升高，6 h時差異極顯著，24 h時差異顯著，其他時間點差異不明顯。由圖2-B可以看出，shRNA質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細胞內(nèi)的 NF-κB 表達量明顯降低，相較于對照組表現(xiàn)出極顯著差異，在12 h時降至最低值。而空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的NF-κB表達量較空白細胞組升高，在6 h時與對照組相比差異顯著，12、48 h與空白對照組相比表現(xiàn)出極顯著差異。由圖2-C可以看出，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細胞內(nèi)的IκB-α表達量明顯降低，相較于對照組表現(xiàn)出極顯著差異，在24 h時降至最低值。而空白質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)的IκB-α表達量較空白細胞組呈上升趨勢，12、24 h時與空白對照組差異顯著，48 h 時差異極顯著。由圖2-D可以看出，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染IPEC-J2后，細胞內(nèi)的MyD88表達量明顯降低，相較于對照組顯示出極顯著差異，在48 h時降至最低值。而空白質(zhì)粒組在6、48 h時細胞內(nèi)的MyD88表達量較空白細胞組略微升高，而12、24 h時的表達量略微降低，與空白對照組間差異不顯著。

2.3IPEC-J2細胞中細胞因子的ELISA檢測結(jié)果

由圖3-A可以看出，在各時間點，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中的NF-κB含量明顯低于空白細胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，6 h時與空白組間差異極顯著，其余時間均顯示出顯著差異。由圖3-B可以看出，在轉(zhuǎn)染12～48 h，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中的IκB-α含量明顯低于空白細胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并在12、48 h時與空白對照間顯示出顯著差異，24 h時差異極顯著。由圖3-C可以看出，在各時間點，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中的TNF-α含量明顯低于空白細胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并在6、24、48 h時與空白對照組間顯示出極顯著差異，12 h時差異顯著。由圖3-D可以看出，在各時間點，shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞中的IL-1含量明顯低于空白細胞組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并在24、48 h時與對照組顯示出極顯著差異，在6、12 h時與空白對照組間差異顯著。

3討論

在TLR4/NF-κB信號通路中，泛素扮演著重要的角色，研究認為，很多泛素化抑制因子可以作為治療許多疾病的新靶點[11-14]。Marfella等的研究表明，通過免疫組織化學方法和酶聯(lián)免疫分析的方法，應用羅格列酮抑制泛素-蛋白酶體途徑，可以通過減少IκB（轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制子）的降解，從而抑制與NF-κB相關(guān)的炎癥過程[15]。目前，針對泛素蛋白酶體系統(tǒng)的生物學靶點已經(jīng)在蛋白酶體抑制劑與E1（泛素活化酶）、E2（泛素結(jié)合酶）、E3（泛素連接酶）方面得到擴展。在大多數(shù)腫瘤細胞中，泛素分子都呈高表達狀態(tài)[16]。Choongseob等通過降低泛素UBB基因的表達量而成功抑制了體內(nèi)、外腫瘤細胞的生長，其機制是通過促進細胞凋亡及調(diào)節(jié)NF-κB分子通路實現(xiàn)的[17-18]。因此可見，泛素化是調(diào)節(jié)NF-κB活化的一種重要機制。

在本試驗中，通過構(gòu)建shRNA質(zhì)粒對泛素基因進行沉默，下調(diào)或終止其表達，可以達到抑制泛素蛋白合成的目的，研究轉(zhuǎn)染該質(zhì)粒后對豬小腸上皮細胞中TLR4/NF-κB信號通路的作用。結(jié)果顯示，細胞內(nèi)TLR4的mRNA表達量比空白對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組低，隨著轉(zhuǎn)染時間增加，表達量逐漸降低，并在24 h時降至最低值;NF-κB的mRNA表達量也明顯低于空白細胞組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，在12 h時降至最低值后逐漸升高，但仍低于空白細胞組中的NF-κB含量;IκB-α、MyD88的mRNA表達量也都低于同組的空白細胞組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，并且隨著轉(zhuǎn)染時間的增加，mRNA的表達量逐漸降低，均在24 h時出現(xiàn)最小值。試驗結(jié)果表明，泛素基因沉默以及泛素的表達量下調(diào)，對TLR4/NF-κB信號通路起到了抑制作用，各下游分子的表達量均出現(xiàn)降低，其抑制作用很可能是通過抑制泛素化降解IκB而實現(xiàn)的。

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