微囊藻毒素LR免疫原及包被抗原的合成與鑒定

何丹　劉媛　李先保　龔航　王麗　郝佳　張曉帥　徐重新　張存政　劉賢金

摘要：微囊藻毒素LR（MC-LR）分子量小于1 000 u，為半抗原，需要與載體蛋白偶聯(lián)后才能刺激免疫應答用于抗體制備。本研究利用碳二亞胺法將MC-LR分別與鑰孔血藍蛋白（KLH）和牛血清白蛋白（BSA）進行偶聯(lián)，獲得免疫抗原（MC-KLH）和包被抗原（MC-BSA）。采用紫外掃描光譜、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）等3種方法對2種人工抗原進行鑒定，并對小鼠進行免疫。用間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和競爭ELISA測定了抗血清效價和敏感度。結(jié)果表明，紫外掃描光譜法可觀察到2種人工抗原的紫外吸收譜與載體蛋白相比發(fā)生改變。通過SDS-PAGE法可以觀察到MC-BSA分子量比BSA增大。另外質(zhì)譜法測定的MC-BSA的相對分子量為76 515.84，計算得到的MC-LR與BSA的偶聯(lián)比為10 ∶1。MC-KLH免疫小鼠后，抗血清效價最高達到1 ∶32 000倍，MC-LR對鼠多抗血清的抑制中濃度（I50）為0.53 μg/mL。成功合成了MC-LR的免疫原和包被原為其單克隆抗體的制備奠定了基礎。還比較了3種鑒定方法的適用性和優(yōu)缺點，為其他人工抗原的鑒定方法提供了有益的參考。

關鍵詞：微囊藻毒素LR;抗體;免疫原;包被原;鑒定

中圖分類號：X52 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0226-05

微囊藻毒素（microcystins，簡稱MCs）是一種在藍藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產(chǎn)生量最大和造成危害最嚴重的藻毒素種類[1]，其主要結(jié)構(gòu)為環(huán)D-丙氨酸-R1-R2-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Z-adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸，其中有2個可變的L-型氨基酸（R1和R2），這2種L-型氨基酸的不同組合更替及其他氨基酸的去甲化衍生出眾多的毒素類型，至今已發(fā)現(xiàn)80種以上的MCs異構(gòu)體[2-4]（圖1）。其中微囊藻毒素LR（MC-LR）是已知毒性最強、急性危害最大的一種淡水藍藻毒素，具有多器官毒性、遺傳毒性和致癌性[5]。世界衛(wèi)生組織及許多發(fā)達國家制定的引用水標準和規(guī)范中規(guī)定，MC-LR的含量不得超過 1.0 μg/L，我國生活飲用水衛(wèi)生標準也規(guī)定飲用水中的 MC-LR不得超過1.0 μg/L[6]。

目前MC-LR的檢測方法主要包括液相色譜法、免疫分析法、磷酸酶抑制法、細胞毒性法和生物分析法等[7-15]。免疫分析法因其靈敏度高、檢測通量大等優(yōu)點成為MC-LR最常用的篩選檢測方法，其核心試劑抗體的制備國內(nèi)外已有一些文獻報道[16]。然而目前商品化的MC-LR抗體仍然非常有限，且質(zhì)量參差不齊。進口的MC-LR單克隆抗體主要為英國Abcam公司的產(chǎn)品，售價約達3 000元/mg。國內(nèi)僅有中國水生生物研究所、江蘇省微生物研究所和清華大學等少數(shù)幾家單位研制的MC-LR單、多克隆抗體。現(xiàn)有的商品化MC-LR抗體難以完全滿足巨大市場檢測需求和科研使用。因此，加快MC-LR單克隆抗體的研制和自主知識產(chǎn)權的快速檢測技術產(chǎn)品的研發(fā)，為解決我國特別是江蘇地區(qū)太湖藍藻暴發(fā)水體污染監(jiān)測等社會、環(huán)境問題意義重大。

由于MC-LR分子量為995.17 u，屬于半抗原，必須要和載體蛋白偶聯(lián)才能具有免疫原性，從而獲得抗體。因此，合成性能良好的免疫原及包被原是制備抗體和建立檢測方法的關鍵。本研究利用碳二亞胺法將MC-LR與載體蛋白鑰孔血藍蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）分別進行偶聯(lián)，作為免疫原和包被原，并用紫外掃描光譜、十二烷基硫酸鈉聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）等3種方法進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 主要材料

微囊藻毒素LR，購自瑞典A1exis Biochem公司。6～8周齡雌性Balb/c小鼠，購自江蘇省揚州大學比較醫(yī)學中心。鑰孔血藍蛋白、牛血清白蛋白、50%聚乙二醇（PEG）溶液（分子量為1 450 ku）、弗氏完全和不完全佐劑，均購自美國Sigma公司。N，N-二甲基甲酰胺（DMF），購自無錫中西藥品器械集團有限公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠IgG，購自南京康維生物科技有限公司。1-乙基-3（3-二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、N-輕基琥珀酰亞胺（NHS）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB），均購自上海麗珠東風生物技術有限公司。透析帶（截留分子量為14 000 ku），購自上海華美生物工程有限公司。4×蛋白上樣緩沖液、脫脂奶粉，均購自索萊寶生物科技有限公司。10%預制膠，購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

酶標儀（美國Thermo），洗板機（美國Thermo），臺式冷凍離心機（美國Beckman），紫外-可見分光光度計（美國PerkinElmer），微量可調(diào)移液器 （芬蘭Finnpipette），超純水凈化儀（美國Millipore），分析天平（美國OHUS），磁力攪拌器（杭州儀表電機有限公司），96孔酶標板（美國CORNING），垂直板電泳儀（美國Bio-rad），MALDI-TOF/TOF 5800質(zhì)譜分析儀（美國AB Sciex公司），5% CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo）等。

1.3 免疫抗原和包被抗原的合成

免疫抗原（MC-KLH）的制備：MC-LR與KLH的偶聯(lián)，參考Yu等的方法[17]。具體為取0.1 mg MC-LR溶解于 0.1 mL DMF，再與0.3 mL溶解有6 mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸酸（EDC·HCl）和6 mg NHS的DMF溶液混合，輕微振蕩并混勻，室溫反應30 min后，4 ℃反應過夜，得MC-LR活潑酯衍生物（Ⅰ）。稱取 3 mg KLH溶解于3 mL 0.1 mol/L pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液（CBS）中，將衍生物（Ⅰ）緩慢滴加入KLH溶液中，輕微振蕩并混勻，避光室溫反應2 h。將反應物移入透析袋，透析袋放在pH值為7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）中，4 ℃下透析2 d，每天更換透析液3次，透析產(chǎn)物分裝后于-20 ℃保存。

包被抗原（MC-BSA）的制備：將0.1 mg MC-LR溶解于25%乙醇溶液中，再加入335 μg BSA，振蕩混勻。隨后將溶有1 mg EDC·HCl 的200 μL水溶液逐滴加入MC-LR和BSA的混合液中，4 ℃反應過夜。制備好的包被抗原裝入透析袋，在PBS緩沖液中4 ℃下透析2 d，每天更換透析液3次，分裝后于-20 ℃保存。

1.4 鑒定方法

1.4.1 紫外掃描光譜法 將免疫抗原、包被抗原溶解于PBS中，使其濃度為200 μg/mL，載體蛋白KLH、BSA濃度為 1 mg/mL，半抗原MC-LR濃度為10 μg/mL，用紫外分光光度計對各物質(zhì)進行紫外全波長掃描，繪制紫外吸收曲線。

1.4.2 SDS-PAGE法 配制200 μg/mL的MC-BSA和BSA，與蛋白上樣緩沖液混合后，煮沸3 min。樣品上樣量為 5 μL/孔，蛋白marker上樣量為2 μL/孔。使用10%的預制膠分離，140 V恒壓下電泳70 min，通過銀染法顯色。

1.4.3 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法 將1 μL 0.5 mg/mL PBS溶解的BSA或MC-BSA偶聯(lián)物點至樣品靶上，自然干燥后，再取0.6 μL CHCA基質(zhì)溶液點至對應靶位上并自然干燥，用相同方法在樣品靶位相鄰位置點標準品。在正離子模式下選擇反射方法對樣品測試范圍進行校準測試。反射校準物質(zhì)范圍為39 212±100至66 430±100;在正離子模式下選擇反射方法測試樣品分子量。質(zhì)譜數(shù)據(jù)及圖譜處理由MALDI-TOF MS產(chǎn)生，原始數(shù)據(jù)及圖譜由4000 Series Explorer V3.5軟件導出。按照以下公式計算半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比：偶聯(lián)比=（偶聯(lián)物分子量-載體蛋白分子量）/半抗原分子量。

1.5 動物免疫

取適量的MC-KLH與等體積完全弗氏佐劑混合，完全乳化，免疫3只6～8周齡雌性Balb/c小鼠，25 μg/只腹腔注射。3周后，取適量的MC-KLH與等體積不完全弗氏佐劑混合，乳化后皮腹腔注射，根據(jù)此方法每14 d免疫1次，共加強免疫4次。選取效價最高小鼠，用PBS溶解的25 μg MC-KLH進行腹腔注射，進行沖擊免疫，3 d后取脾臟融合。

1.6 抗血清效價及靈敏度的測定

1.6.1 間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定效價 （1）包被：用 2.5 μg/mL CBS稀釋的MC-BSA，100 μL/孔加入酶標板，4 ℃ 包被過夜。（2）封閉：次日用含有0.05% Tween 20的PBS溶液（PBST）洗板3次，每孔加入200 μL PBS配制的體積分數(shù)為2%的脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h。（3）加樣：PBST洗板3次后，每孔加入100 μL PBS梯度稀釋的鼠陽性血清，以相應稀釋倍數(shù)的鼠陰性血清作為陰性對照，37 ℃溫育1 h。（4）加酶標二抗：PBST洗板3次，每孔加入100 μL HRP標記的羊抗鼠IgG工作液（1 ∶5 000倍PBS稀釋），37 ℃溫育1 h。（5）顯色：PBS洗板3次后，每孔加入100 μL現(xiàn)配的底物溶液（100 μL二甲亞砜溶解的TMB和25 μL 0.65% H2O2加入9 .875 mL 0.1 mol/L pH值為5.5的檸檬酸緩沖液），37 ℃顯色15 min后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液終止反應，在酶標儀上讀取450 nm處的吸光度，以大于相應的陰性血清吸光度2.1倍的陽性血清最大稀釋倍數(shù)作為抗血清效價。用方陣滴定法確定包被抗原及鼠血清的工作濃度。

1.6.2 間接競爭ELISA測定抗血清敏感度 酶標板的包被及封閉、加酶標二抗和顯色步驟同“1.6.1”節(jié)。加樣步驟操作如下：用PBS將MC-LR標準品稀釋成100、10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL等6個濃度，酶標板每孔加入50 μL 不同濃度MC-LR標準品和50 μL 2倍工作濃度的鼠抗血清混合液，以50 μL PBS和50 μL 2倍工作濃度的鼠抗血清混合液作為零濃度的MC-LR。計算不同濃度MC-LR標準品對應吸光度（B）與零濃度MC-LR對應吸光度（B0）的比值，繪制MC-LR濃度與B/B0的標準抑制曲線，并計算抑制中濃度（I50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外掃描光譜法

紫外掃描光譜法是免疫抗原和包被抗原鑒定的一種常用方法。它是通過比較載體蛋白、人工抗原、半抗原的紫外吸收光譜的遷移或疊加情況來分析偶聯(lián)結(jié)果。圖2-A顯示了免疫抗原MC-KLH、半抗原MC-LR和載體蛋白KLH的紫外掃描光譜。在紫外掃描范圍內(nèi)，半抗原MC-LR在238 nm處具有特征吸收峰，KLH在280 nm處具有蛋白質(zhì)特征吸收峰，在 253 nm處出現(xiàn)波谷。偶聯(lián)物MC-KLH在238～280 nm范圍內(nèi)，紫外吸收曲線呈平滑下降趨勢，沒有KLH的280 nm處的特征吸收峰和253 nm處的波谷出現(xiàn)，這可能是由于MC-LR與KLH偶聯(lián)后，2種物質(zhì)的紫外吸收發(fā)生疊加導致，由此推測MC-LR和KLH偶聯(lián)成功。

同樣圖2-B顯示了包被抗原MC-BSA、MC-LR和BSA的紫外掃描光譜。BSA在280 nm處具有蛋白質(zhì)特征吸收峰，在251 nm處出現(xiàn)波谷。偶聯(lián)物MC-BSA在238～280 nm 范圍內(nèi)，紫外吸收曲線呈平滑下降趨勢，沒有BSA的280 nm處的波峰和251 nm處的波谷出現(xiàn)，這可能是由于 MC-LR 與BSA偶聯(lián)后，兩者紫外吸收發(fā)生疊加導致，由此推測MC-LR和BSA偶聯(lián)成功。

2.2 SDS-PAGE法

SDS-PAGE法是鑒定蛋白分子量的經(jīng)典方法。由于SDS-PAGE法的電泳遷移率主要取決于蛋白分子量的大小，可以通過比較載體蛋白和偶聯(lián)物的電泳遷移率來分析是否偶聯(lián)成功。如圖3所示，BSA的條帶在72 ku下方，符合66 ku 的BSA分子量預期，而MC-BSA的條帶接近于72 ku。MC-BSA 的分子量大于BSA，因此可以推測MC-LR與BSA偶聯(lián)成功。

由于試驗所用的KLH蛋白來源于海洋軟體動物鑰孔帽貝（Megathura crenulata），該蛋白由KLH1和KLH2（350～400 ku）2個亞基聚合而成，分子量范圍在400～800 ku之間。并非單一分子量純品，而且KLH分子量過大不能適用于常規(guī)的蛋白marker及凝膠，因此未用此種方法對MC-KLH進行鑒定。

2.3 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法

MALDI-TOF MS的原理是用一定強度的激光照射樣品與基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，基質(zhì)-樣品直接發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離后在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測其的飛行時間不同而被檢測。即依據(jù)樣品質(zhì)荷比（m/z）不同進行檢測得到樣品的相對分子質(zhì)量。

試驗用MALDI-TOF MS對BSA和MC-BSA進行分子量測定，測定的BSA和MC-BSA相對分子量值分別是 66 455.70、76 515.84（圖4）。MC-BSA分子量比BSA大，證實了MC-LR與BSA偶聯(lián)成功，計算得到的MC-LR和BSA的偶聯(lián)比為10 ∶1。

由于KLH沒有精確的分子量，無法用質(zhì)譜法準確測定MC-KLH的分子量，因此未采用此方法進行鑒定。

2.4 免疫鼠血清效價以及敏感度鑒定

如圖5所示，以大于陰性血清吸光度2.1倍計，3只Balb/c小鼠的抗血清效價在1 ∶8 000～1 ∶32 000之間。選擇效價最高且抑制效果最好的1號鼠抗血清用方陣滴定法優(yōu)化包被原和抗血清工作濃度，優(yōu)化后的包被抗原工作濃度為2.5 μg/mL，抗體稀釋倍數(shù)為1 ∶8 000。在優(yōu)化條件下用間接競爭ELISA法測定抗血清對微囊藻毒素LR的敏感度（圖6），計算得到的 MC-LR對鼠抗血清的抑制中濃度（I50）為0.53 μg/mL。結(jié)果表明，試驗合成的免疫抗原MC-KLH成功刺激小鼠產(chǎn)生免疫應答，并產(chǎn)生了能夠靈敏識別MC-LR的抗體，由此確證了免疫抗原合成成功。

3 討論與結(jié)論

3.1 免疫抗原和包被抗原的合成方法

目前常用的包被抗原和免疫抗原的合成方法有很多，含羧基（—COOH）的半抗原一般采用碳二亞胺法、混合酸酐法、N-羥基丁二酰亞胺活性酯法等合成。含氨基（—NH2）的半抗原一般使用戊二醇法、鹵代硝基苯法、二異氰酸酯法、重氮化法等。含羥基（—OH）的半抗原一般可用琥珀酸酐法、光氣法、鹵代羧基法等合成。含有巰基（—SH）、醛（—CHO）、酮（—CO—）結(jié)構(gòu)的半抗原亦可利用相應的雙功能團試劑與蛋白偶聯(lián)合成[18]。早期，Metcalf等將MC-LR與2-巰基乙胺反應形成氨基乙硫醇-MC-LR，從而引入1個游離氨基，再通過戊二醛法將其與載體蛋白KLH偶聯(lián)[19]。Zeck等則將陽離子化卵清蛋白（cOVA）進行巰基化修飾后，與MC-LR第7位氨基酸（MdhA）進行偶聯(lián) [20]。盛建武等則在MC-LR第7位氨基酸分子上引入1個游離氨基，形成中間產(chǎn)物（H2N-et MC-LR），再使用戊二醇法將其分別與BSA和OVA偶聯(lián)[21]。以上方法雖然獲得了靈敏度較高的抗體，但是須要對MC-LR進行復雜的化學修飾后再與載體蛋白偶聯(lián)。

本研究利用MC-LR的第3位（D-β-Me-Asp）和第6位（D-Glu）氨基酸中的2個游離羧基，用EDC·HCl和NHS將其與載體蛋白進行直接偶聯(lián)。該方法具有無需半抗原修飾的優(yōu)點，大部分試驗易于掌握，而且偶聯(lián)反應條件溫和。另外，本試驗采用了KLH作為免疫原的載體蛋白，KLH分子量巨大（400～800 ku），1個KLH分子帶有數(shù)百個伯氨基基團，可以用于MC-LR偶聯(lián)，相比于BSA或OVA可以引發(fā)更強烈的免疫應答。從小鼠免疫的實際效果來看，本試驗用 MC-KLH 免疫的小鼠最高效價達到1 ∶32 000倍，免疫應答效果良好。

3.2 免疫抗原和包被抗原的鑒定方法

紫外掃描光譜法和SDS-PAGE是國內(nèi)試驗室最常用的2種偶聯(lián)物鑒定方法，它們具有儀器設備價格低以及操作簡便等優(yōu)點。但這2種方法也存在了一定的局限性，如紫外掃描光譜法是通過觀察偶聯(lián)物的紫外吸收譜圖與載體蛋白和半抗原相比有沒有偏移或疊加來推測是否成功，是較為粗略的判斷方法。以本研究為例，MC-KLH和MC-BSA的紫外譜圖雖與載體蛋白存在差異，但偶聯(lián)物并沒有出現(xiàn)明顯的 238 nm 處的半抗原特征吸收峰，因此難以準確判斷是否偶聯(lián)成功。另外用紫外掃描光譜法來計算半抗原與載體蛋白偶聯(lián)比，是通過計算摩爾吸光系數(shù)來換算，結(jié)果并不精確。

SDS-PAGE法是通過比較載體蛋白和偶聯(lián)物電泳遷移率的方法來判斷偶聯(lián)物分子量是否增大。對于本試驗可以明顯觀察到MC-BSA的電泳遷移率低于BSA，證明偶聯(lián)物分子量增大。但是對于許多分子量更小的半抗原以及偶聯(lián)比極低情況，由于載體蛋白分子量較大（通常幾十到幾百ku），偶聯(lián)了幾十到一兩百u的半抗原后，用此方法就難以區(qū)分。另外，也要注意一些電荷異常和構(gòu)象異常及由亞基構(gòu)成的蛋白可能不適用于SDS-PAGE測定分子量，如果采用這些蛋白作為載體蛋白偶聯(lián)，鑒定時應考慮其他方法。

近年來興起的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術，其準確度遠遠高于目前常規(guī)應用的SDS-PAGE與高效凝膠色譜技術，目前可測定生物大分子的分子量高達600 ku。它是通過對蛋白質(zhì)分子離子化后通過質(zhì)荷比進行分析，更能夠準確地獲得蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，從而能精確計算出半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)比。本試驗采用了此種方法精確測定了MC-BSA和BSA的分子量，最終確定了偶聯(lián)比。

另外，本試驗用于制備免疫抗原的KLH由于沒有準確的分子量，難以用SDS-PAGE和MALDI-TOF MS對其偶聯(lián)結(jié)果進行鑒定，但用該免疫原對小鼠免疫后獲得了高效價和靈敏度的抗血清，最終證明了免疫原MC-KLH合成成功。

本研究成功合成了MC-LR的免疫抗原和包被抗原，為其單克隆抗體的制備奠定了基礎。試驗還系統(tǒng)比較了紫外掃描光譜、SDS-PAGE、MALDI-TOF MS等3種鑒定方法的適用性和優(yōu)缺點，為其他人工抗原的鑒定方法提供了有益的參考。

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