表面活性劑溶血能力及其在微核制片中的選擇研究*

林芝源，吳圻榮，李 灝，彭彩霞

(茂名市職業(yè)病防治院，廣東茂名 525011)

表面活性劑有多種功能，應(yīng)用廣泛。某些表面活性劑能使血液細(xì)胞發(fā)生裂解，具有溶血作用，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用來(lái)配制溶血?jiǎng)┗蚯逑磩1]。國(guó)內(nèi)關(guān)于表面活性劑溶血能力的研究報(bào)道較少，曾有學(xué)者用鴨血來(lái)做實(shí)驗(yàn)樣本的溶血研究[2]，但人與動(dòng)物的紅細(xì)胞(RBC)有差異。微核測(cè)試是遺傳毒理學(xué)檢測(cè)方法，是評(píng)價(jià)輻射損傷的指標(biāo)之一，微核制片過(guò)程須除去RBC，對(duì)溶血?jiǎng)┑倪x擇還是一大難題，目前采用的KCl低滲溶血法[3]，其溶血時(shí)間長(zhǎng)，溶血程度較難把握，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用人外周血液為實(shí)驗(yàn)樣本，探討了陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)、非離子表面活性劑辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)、乳化劑辛基苯酚聚氧乙烯(10)醚(OP-10)等的溶血特性，對(duì)選擇表面活性劑CTAB用于微核制片的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，為臨床應(yīng)用溶血試驗(yàn)以及提高微核制片的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 來(lái)自職業(yè)體檢的參檢人員，靜脈抽血，EDTA-K2抗凝，通過(guò)體檢結(jié)果查詢(xún)RBC各項(xiàng)數(shù)據(jù)，選取MCV在85～97 fl之間、Hb在120～168 g/L之間的新鮮血液。另外，選擇MCV分別為：98.1，92.3，86.2，79.8，73.5，67.5和61.7 fl的血液樣本7例，每例樣本一分為二，其中一份作為對(duì)照組。

1.2 儀器和試劑 721分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。CTAB(山東濟(jì)寧化工研究所，AR)；SDS(廣州市中南化工儀器有限公司，AR)；TritonX-100(博美生物科技有限公司，進(jìn)口分裝，純度>99.0%)；OP-10(天津市北聯(lián)精細(xì)化工有限公司，CP)。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本處理：抗凝血液用生理鹽水1∶4稀釋洗滌2次(對(duì)照組除外)，按比容配制成一定濃度的RBC懸液(v/v)。

1.3.2 試劑配制：稱(chēng)量一定重量的表面活性劑，用熱蒸餾水溶解后配制成20 g/L的原液，再用生理鹽水稀釋為應(yīng)用液。

1.3.3 溶血試驗(yàn)：等滲條件下，紅細(xì)胞懸液與表面活性劑溶液混合，溶血15 min，離心吸取上清液稀釋一定的倍數(shù)，于540 nm波長(zhǎng)比色，用吸光度(A)來(lái)比較溶血程度。溶血能力比較試驗(yàn)：50%(v/v)RBC懸液0.50 ml與2.0 g/L表面活性劑溶液0.2 ml混合，重復(fù)3次；溶血敏感度比較試驗(yàn)：3.0%(v/v)RBC懸液與不同濃度的表面活性劑溶液等體積混合(混合液最終濃度為原液的1/2)，觀察5s～10s內(nèi)完全溶血時(shí)(懸液透明)所需表面活性劑的最低濃度，重復(fù)5次；懸液RBC含量對(duì)溶血能力的影響試驗(yàn)：RBC懸液倍比稀釋成7個(gè)梯度(50.00%，25.00%，12.50%，6.25%，3.12%，1.56%和0.78%)，分別取0.50 ml與1.0 g/L的表面活性劑溶液0.15 ml混合，重復(fù)3次；MCV大小、RBC洗滌與否對(duì)溶血能力的影響試驗(yàn)：7例MCV不同的樣本，洗滌組和對(duì)照組(未洗滌)同時(shí)配成25% RBC懸液，分別取1.00 ml與1.0 g/L的CTAB 溶液0.20 ml混合，重復(fù)3次。

1.3.4 白細(xì)胞形態(tài)改變的觀察與判斷標(biāo)準(zhǔn)：取濃度分別為0.1，0.5和1.0 g/L的CTAB溶液與3%(v/v)RBC懸液等體積混合(混合液最終濃度為原液的1/2)，完全溶血后(約10 s)用顯微鏡觀察白細(xì)胞形態(tài)的變化，重復(fù)5次。判斷標(biāo)準(zhǔn)：白細(xì)胞形態(tài)完整，胞膜圓滑(-)；出現(xiàn)胞漿膨出或胞膜陷入的細(xì)胞(±)；胞漿膨出或胞膜陷入的細(xì)胞占20%以上(+)；見(jiàn)到胞漿消失的裸核(++)；裸核占20%以上(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溶血能力比較 4種表面活性劑CTAB，SDS，TritonX-100和OP-10的溶血結(jié)果(相對(duì)A值)分別為：0.635，0.382，0.205和0.198，溶血能力強(qiáng)弱依次為：CTAB>SDS>TritonX-100>OP-10。

2.2 溶血敏感度比較 10 s內(nèi)完全溶解1.5%(v/v)RBC懸液時(shí)，混合液所需各種表面活性劑的最低濃度分別為CTAB：0.05 g/L，SDS：0.08 g/L，TritonX-100：0.14 g/L和OP-10：0.15 g/L。

2.3 RBC含量對(duì)溶血能力的影響 結(jié)果見(jiàn)表1。RBC濃度由低到高，4種表面活性劑的吸光度(相對(duì)A值)在一定范圍內(nèi)與RBC濃度呈正比，當(dāng)溶血不完全時(shí)，隨著RBC含量的增加而降低，溶血程度曲線(xiàn)表現(xiàn)為兩邊低中間高的峰形。

表1 RBC含量對(duì)溶血能力的影響(相對(duì)A值)(n=3)

2.4 MCV大小、RBC洗滌對(duì)溶血能力的影響 結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)照組吸光度(相對(duì)A值)低于洗滌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.366，P=0.018)；兩組的吸光度(A值)都隨著MCV的減小而降低。

表2 MCV大小、RBC洗滌對(duì)溶血能力的影響(相對(duì)A值)(n=3)

2.5 CTAB對(duì)白細(xì)胞形態(tài)的影響 結(jié)果見(jiàn)表3。在0.05 g/L CTAB混合液中，RBC溶解后白細(xì)胞(粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)胞漿仍保持完整，60 s出現(xiàn)胞漿膨出或胞膜陷入的不規(guī)則形狀，300 s后或CTAB濃度增大時(shí)，可見(jiàn)到胞漿消失的裸核。

表3 CTAB對(duì)白細(xì)胞形態(tài)的影響(n=5)

3 討論

3.1 目前，表面活性劑溶血機(jī)理尚未清楚，一般認(rèn)為是表面活性劑對(duì)細(xì)胞膜上的脂類(lèi)有特殊作用，能使細(xì)胞膜發(fā)生變化，低濃度時(shí)可改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜的滲透性，使細(xì)胞吸水后膨脹破裂而導(dǎo)致溶血；當(dāng)濃度高達(dá)一定范圍時(shí)，表面活性劑在細(xì)胞膜上達(dá)到飽和，使細(xì)胞膜發(fā)生溶解導(dǎo)致溶血[4]。另一方面，細(xì)胞膜表面的脂蛋白對(duì)表面活性劑有淬滅作用，膜表面的脂蛋白越多，表面活性劑對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用越弱[5]。

本課題用人外周血液探討了各種表面活性劑的溶血特性，研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子表面活性劑CTAB的溶血能力最強(qiáng)，這與文獻(xiàn)[2]報(bào)道的TritonX-100溶血能力最強(qiáng)、SDS溶血能力大于CTAB的結(jié)果不相符，這是否為試驗(yàn)方法或是試驗(yàn)材料的差異，有待以后深入研究。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)溶解液中RBC過(guò)剩時(shí)，溶血程度隨著RBC含量的增加而降低，可能是紅細(xì)胞膜表面的脂蛋白對(duì)表面活性劑有淬滅作用，出現(xiàn)抗溶血作用的緣故，因?yàn)镽BC含量越多，膜表面積越大，脂蛋白含量越多。此外，本研究結(jié)果還顯示，RBC濃度(v/v)一定時(shí)，溶血程度隨著MCV的減小而降低，也可能與紅細(xì)胞膜表面積比例增大有關(guān)，因?yàn)橄嗤热莸膽乙?，RBC體積越小，其含細(xì)胞數(shù)越多，膜表面積也越大。這些研究結(jié)果提示紅細(xì)胞膜對(duì)表面活性劑有一定的抗溶血作用，一定濃度的混合液紅細(xì)胞膜表面積越大，溶血程度越低。另外，本研究結(jié)果還顯示，未洗滌RBC懸液其溶血程度低于洗滌組(P<0.02)，可能是未洗滌RBC懸液含有較多的血漿，血漿中的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)等成分消耗了部分表面活性劑的緣故。這表明血漿對(duì)表面活性劑有一定的降溶血作用。

本實(shí)驗(yàn)表3結(jié)果顯示，在0.05 g/L CTAB溶解液中，紅細(xì)胞溶解后，白細(xì)胞胞漿仍保持一定的時(shí)間，最后才變?yōu)槁愫?。這表明，在低濃度的CTAB溶解液中，CTAB對(duì)紅細(xì)胞膜的破壞作用較白細(xì)胞強(qiáng)。

3.2 微核制片過(guò)程的主要步驟是除去紅細(xì)胞，獲得足夠數(shù)量的淋巴細(xì)胞，如何去除紅細(xì)胞而又保證淋巴細(xì)胞的完整是微核制片的關(guān)健[6]，因此，微核制片所用的溶血?jiǎng)┍仨毦哂袑?duì)紅細(xì)胞的破壞作用較淋巴細(xì)胞強(qiáng)、或者選擇性地破壞紅細(xì)胞的功能。本研究結(jié)果表明，低濃度的CTAB溶液具有對(duì)紅細(xì)胞的破壞作用較淋巴細(xì)胞強(qiáng)的特性，適用于微核制片。這是由于紅細(xì)胞膜與淋巴細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和成份比例有差異[7]，對(duì)表面活性劑的敏感性不同，可以作如下解釋?zhuān)孩偌t細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，易與陽(yáng)離子表面活性劑CTAB通過(guò)靜電作用吸附于其表面[8]，加速其溶解過(guò)程。②低濃度的表面活性劑能改變細(xì)胞膜的滲透性，使細(xì)胞吸水膨脹，而紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)膨脹的耐受能力較差，易破裂。③脂蛋白對(duì)表面活性劑有淬滅作用，在各種細(xì)胞中，紅細(xì)胞膜表面含脂蛋白最少[5]，在同一溶解液中比其他細(xì)胞先溶解。④隨著RBC的溶解，CTAB本身被消耗，使其在溶液中的游離濃度逐漸降低，隨后減弱了溶解液對(duì)淋巴細(xì)胞的破壞作用。因此，在合適的CTAB濃度和一定的溶血時(shí)間內(nèi)，能使紅細(xì)胞完全溶解，而淋巴細(xì)胞維持原有體積狀態(tài)，然后經(jīng)固定劑固定，使胞漿得以保留[9]?？梢?jiàn)，用表面活性劑CTAB溶血除去紅細(xì)胞，與常規(guī)低滲法相比較，更容易獲得胞漿完整的淋巴細(xì)胞。

綜上所述，表面活性劑溶血能力與RBC含量、MCV大小、RBC洗滌與否等有關(guān)，陽(yáng)離子表面活性劑CTAB的溶血能力最強(qiáng)，對(duì)紅細(xì)胞的破壞作用較各種白細(xì)胞強(qiáng)，是分離血液淋巴細(xì)胞的較理想溶血?jiǎng)?，但是，如果濃度過(guò)高或溶血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超出了其承受的限度，細(xì)胞膜也會(huì)受損甚至成為裸核，因此，掌握表面活性劑的溶血特性，調(diào)試合適的濃度比例和溶血時(shí)間，是獲得高質(zhì)量微核制片的關(guān)鍵。