五種國產(chǎn)甘膽酸均相酶免疫法檢測試劑的分析性能驗證*

張曙晴，張駱軍

(南通市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226002)

甘膽酸(CG)是膽酸與甘氨酸結合而成的結合型膽酸，也是膽汁酸的主要成分，肝臟是其代謝的重要器官。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG的能力下降，致使血中CG含量升高[1]，故臨床常將CG作為肝細胞損害的指標，同時CG也可作為肝病嚴重程度以及肝損傷疾病鑒別診斷的指標[2]。目前CG檢測的常規(guī)方法主要有放射免疫法、膠乳增強免疫比濁法和均相酶免疫法，放射免疫法試劑穩(wěn)定性差、檢測用時長、環(huán)境要求高，臨床廣泛應用受限，膠乳增強免疫比濁法試劑性能劣于均相酶免疫法[3-4]，故均相酶免疫法更能滿足臨床檢測CG的需求。本研究按照美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)的相關文件要求，以我室當前使用的蘇州博源公司CG試劑為參考試劑，將其與其它四個廠家的試劑進行性能驗證、分析比對，為臨床實驗室選擇適合自己實驗室的CG試劑提供參考。

1材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 所有標本均為清晨空腹8 h后采集靜脈血，并立即離心分離血清，避免使用溶血、脂血、黃疸標本，血清分裝后于-20℃凍存。

1.1.2 精密度驗證標本：選取3份高、中、低濃度的CG血清，分別為0.9 mg/L，2.8 mg/L和45.0 mg/L。

1.1.3 線性范圍評價標本：選取接近試劑盒標注線性范圍的高、低值血清標本各1份，低值為1號，高值為6號，二者再分別以4∶1，3∶2，2∶3，1∶4比例混勻，形成6個濃度梯度的混合血清。

1.1.4 比對標本：隨機選取2018年6月我院住院患者新鮮血清40份，其中異常標本20份。

1.2 試劑與儀器 5種CG試劑均為均相酶免疫法，分別為A：蘇州博源，B：安徽，C：浙江，D：重慶，E：貴州。各試劑均使用各自配套的校準品及質控品，按照廠家推薦的參數(shù)進行校準，檢測各自配套的質控品且均在控。儀器為日立 HITACHI7600全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 精密度評價：依據(jù)CLSI EP15-A文件所提供方案[5]，用5種試劑分別測定高、中、低值3個水平的CG血清，連續(xù)測定5天，每天測4次，計算各試劑各水平的批內(nèi)CV及總CV(CV%within，CV%total)，并判斷精密度是否符合廠家標注。

1.3.2 線性范圍評價：依據(jù)CLSI EP6-A文件所提供方案[6]，用5種試劑分別檢測6個濃度梯度的混合血清，各濃度測定3次并計算平均值，檢查離群值及重復性，將預期值與實測值進行曲線擬合，多元回歸分析，以r2>0.95，斜率b在0.95～1.05范圍內(nèi)判斷該試劑驗證濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.3.3 比對試驗：依據(jù)CLSI EP9-A2文件所提供方案[7]，用5種試劑分別檢測40份比對血清，以A試劑測定結果為X，分別以B，C，D，E試劑結果為Y，繪制散點圖，顯示回歸方程，計算平均絕對偏倚，以超過10%為標準判斷兩者是否等效。

1.3.4 一致率比較：將40份標本的比對結果分別按照各試劑提供的參考范圍上限為標準，高于標準為陽性，低于標準為陰性，比較判定CG異常的一致率，并進行Kappa一致性檢驗，以Kappa值≥0.75表示兩者一致性為優(yōu)。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用Microsoft EXCEL 2003及SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用K-S正態(tài)分布檢驗檢查數(shù)據(jù)正態(tài)性，以P>0.05表示數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。相關性分析采用Pearson相關分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。線性回歸采用簡單線性回歸分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。采用Kappa一致性檢驗比較各試劑與參考試劑判定異常時的一致性。

2結果

2.1 精密度評價 見表1。

表1 五種試劑的精密度

A，B，D，E試劑實測精密度均小于試劑盒標注的精密度，其中E試劑CV%within及CV%total最小。C試劑低值CV%within和低、中值CV%total均高于廠家標注，精密度驗證未通過。D試劑低值水平CV%total大于本實驗室CG檢測的最大允許誤差(CV%total<10%)。

2.2 線性范圍評價 A～E試劑線性范圍分別為0.89～43.58 mg/L，0.90～44.72 mg/L，0.96～41.31 mg/L，0.82～42.29 mg/L和0.78～46.24 mg/L。CG實測值無明顯離群值，最佳擬合方程為一次多項式，預期值與實測值擬合方程斜率b分別為1.038，0.964，0.908，0.984和1.040，r2為0.993～0.998，平均絕對偏差分別為4.16%，5.17%，8.85%，4.92%和4.38%。C試劑線性范圍驗證未通過。

2.3 比對試驗 見圖1。B，C，D，E試劑與A試劑比對結果。

圖1 B，C，D，E試劑與A試劑比對結果

B～E試劑與A試劑比對均呈良好的線性關系，r2為0.924～0.990，平均絕對偏倚分別為6.67%，36.3%，9.80%和16.45%，C，E試劑與A試劑結果不等效。

2.4 一致率比較 B～E試劑與A試劑一致率分別為90%，82.5%，82.5%和90%，經(jīng)Kappa檢驗，Kappa值分別為0.80(P=0.000)，0.65(P=0.000)，0.65(P=0.000)和0.75(P=0.000)，B，E試劑與A試劑一致性優(yōu)。

3討論機體內(nèi)CG是由肝臟合成、分泌、攝取，膽管膽囊參與排泄，臨床多種常見的肝膽疾病(如急慢性肝炎、肝硬化、膽石癥等)血液中CG均顯著升高，且具有出現(xiàn)早、消退晚、敏感度高的優(yōu)點[8]。妊娠中晚期，產(chǎn)科常用CG來反映妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的嚴重程度以及預測是否發(fā)生胎兒窘迫[9-10]。同時CG也作為判斷腸道惡性腫瘤發(fā)生、診療效果及預后的指標[11]。因此實驗室開展CG檢測，對多種疾病的診斷、治療、預后判斷均具有指導意義。

臨床檢測CG廣泛使用均相酶免疫法，它采用酶標記半抗原和標本中未標記半抗原與定量抗體競爭性結合，推算標本中半抗原的含量。該方法敏感度高、穩(wěn)定、方便。本室參考CLSI文件，對國內(nèi)常見的5種CG試劑精密度、線性范圍進行驗證，并對結果進行比對。研究表明除C試劑外，其它試劑精密度驗證均通過，但D試劑在低值水平處CV%值大于本室CG的最大允許誤差。故在本實驗室現(xiàn)有的日常常規(guī)檢測條件下，A，B，E試劑均可滿足臨床需要，尤以E試劑最佳。C試劑精密度驗證未通過，觀察數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)，C試劑從檢測第4天起，低、中值水平檢測結果輕微下降，而第5天各批次血清下降更為明顯，最終導致總變異上升超標。考慮一方面各廠家試劑存在差異，開瓶后穩(wěn)定期不同，另一方面我室試劑開瓶上機后，試劑存儲的環(huán)境波動以及反復接觸檢測的過程中，可能存在累積污染，C試劑更易引起變質。具體原因還有待進一步研究考證。

A，B，D，E試劑線性范圍良好，驗證通過，但C試劑在低值處多點偏差大于可接受范圍，驗證未能通過。所以我們應當注意廠家提供的線性范圍是在特定儀器及環(huán)境中制定的，同一試劑在不同實驗室、不同儀器上檢測時，線性范圍存在一定差異，故各實驗室初次使用某廠家試劑時，不能盲目采用說明書上標注的，應進行線性范圍驗證。

比對試驗中，B～E試劑與A試劑均線性關系良好，但C，E試劑平均絕對偏倚都超過10%，所以C，E試劑與A試劑結果不等效，故我們在臨床應用時應注意結果不可比。異常一致性比較中，C，D試劑與A試劑一致性中等，故實驗室應用C，D試劑時應建立自己的參考范圍，并驗證臨床適用性。

通過此次驗證實驗，我們發(fā)現(xiàn)不同廠家的CG試劑各項性能略有不同，建議臨床檢測CG時，各實驗室對試劑和儀器組成的檢測系統(tǒng)應進行綜合性能驗證，選用適合自己實驗室的試劑，提高檢測的準確性，為臨床提供更優(yōu)質的服務。