非小細(xì)胞肺癌患者血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)與臨床特征及術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究*

黃 剛，陳 霏，肇玉博，張 迪

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽(yáng) 712000；2.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽(yáng) 712000)

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是其最常見(jiàn)的類型[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長(zhǎng)度為19～22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，其作為一類高度保守的非蛋白編碼RNA參與基因表達(dá)的調(diào)控[2]。本文回顧性分析55例行完全切除術(shù)的NSCLC患者的臨床資料，探討血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)與NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年4月～2018年4月期間在陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院和陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院胸外科行手術(shù)切除術(shù)的55例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，依據(jù)術(shù)后復(fù)發(fā)情況分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。復(fù)發(fā)組36例，其中男性 25例，女性11例，平均年齡57.1±7．5歲；未復(fù)發(fā)組19例，其中男性14例，女性5例，平均年齡58.2±7.3歲。所取標(biāo)本均經(jīng)過(guò)病理學(xué)證實(shí)，符合衛(wèi)生部2011年版原發(fā)性肺癌診療規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)[3]。選取同期體檢健康者50例作為對(duì)照組，其中男性30例，女性20例，平均年齡59.7±7.1歲。非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)中、術(shù)前均未接受放療、化療及免疫治療。所有患者均符合完全切手術(shù)指征并接受了完全切除術(shù)。三組研究對(duì)象的年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院和陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并得到所有患者或親屬的知情同意。

1.2 儀器與試劑 湖南湘怡CTK80離心機(jī)、羅氏公司Elecscy 601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀。總RNA提取試劑采用北京先鋒生物公司FAST1000試劑盒。熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技公司。采用美國(guó)ABI-step one熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 非小細(xì)胞肺癌患者完成解剖性肺葉切除：肺葉切除后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃，所有入組患者均為R0切除，達(dá)到根治性手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后病理分期ⅠB期且并發(fā)高危因素的患者及Ⅱ期以上患者建議輔助化療3～4周期，采用含鉑類的雙藥方案。術(shù)后5年之內(nèi)，每6個(gè)月行胸部CT檢查。所有患者每年接受1次上腹部B超，頭顱CT或者M(jìn)RI及全身骨掃描檢查。術(shù)后每6個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，記錄患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)情況，包括復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的首發(fā)部位，出現(xiàn)的具體時(shí)間。

總RNA提取采用Trizol法。血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)。血清CYFRA21-1和CEA水平采用羅氏公司的Elecscy601電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)測(cè)定，血清CYFRA21-1和CEA參考值范圍分別為0～6.3 ng/ml，0～3.5 ng/ml。

1.3.2 標(biāo)本采集與處理：抽取所有研究對(duì)象肘靜脈血10 ml，未復(fù)發(fā)組于術(shù)后2周采取，復(fù)發(fā)組在CT或者M(jìn)RI掃描顯示有局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)時(shí)采集，對(duì)照組于體檢時(shí)采集。采取的血液分為兩管，一管置于EDTA抗凝管中，在4℃環(huán)境以3 000 r/min的速度離心20 min后，收集血漿，用于檢測(cè)miRNA-145和miRNA-221表達(dá)。另一管分離血清用于檢測(cè)CEA和CYFRA21-1水平，分離的血清和血漿于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 RT-PCR：總RNA提取采用Trizol法。引物設(shè)計(jì)采用pfimer5軟件，使用實(shí)時(shí)反應(yīng)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。U6作為內(nèi)參照。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，然后以94℃20 s，60℃20 s和72℃40 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，通過(guò)2-△Ct求出miRNA-145和miRNA-221的相對(duì)表達(dá)量。

表1 miRNAs引物序列

2結(jié)果

2.1 NSCLC患者血清CYFRA21-1和CEA水平比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組的CYFRA21-1和CEA水平顯著增高；而與未復(fù)發(fā)組比較，復(fù)發(fā)組的兩腫瘤標(biāo)志物水平顯著增高；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

表2 NSCLC患者血清CYFRA21-1和CEA水平比較

2.2 NSCLC患者血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。未復(fù)發(fā)組的miRNA-221表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而顯著低于復(fù)發(fā)組；未復(fù)發(fā)組的miRNA-145表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而顯著高于復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 相關(guān)性分析 肺癌患者術(shù)后5年生存率為55.35%。在復(fù)發(fā)組中血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，見(jiàn)圖1。miRNA-145表達(dá)分別與CYFRA21-1和CEA水平有負(fù)相關(guān)性(P<0.01)，見(jiàn)圖2～3，而miRNA-221表達(dá)分別與CYFRA21-1和CEA水平有正相關(guān)性(P<0.01)，見(jiàn)圖4～5。血漿miRNA-221和miRNA-145表達(dá)在鱗癌中的異常率高于腺癌，在TNMⅢ期中的異常率高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，見(jiàn)表4；兩標(biāo)志物與患者年齡、腫瘤大小和吸煙無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表3 NSCLC患者血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)水平比較

表4 NSCLC患者臨床特征分析(%)

圖1 miRNA-145與miRNA-221相關(guān)性分析 圖3 miRNA-145與CYFRA21-1相關(guān)性分析

圖2 miRNA-145與CEA相關(guān)性分析 圖4 miRNA-221與CEA相關(guān)性分析

圖5 miRNA-221與CYFRA21-1相關(guān)性分析

3討論目前早期非小細(xì)胞肺癌的治療已取得了很大進(jìn)展，尤其是IA腫瘤期患者手術(shù)切除預(yù)后良好，5年生存率達(dá)到83.9%。但大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者到了晚期才能得到正確的診斷，總生存率很低[4]，因此早期正確診斷并及時(shí)治療可降低非小細(xì)胞肺癌患者的死亡率。更多的研究顯示，外周血中microRNA的差異性表達(dá)可以識(shí)別多種人類腫瘤。miRNA-145被證實(shí)與前列腺癌、膀胱癌、食管癌、卵巢癌和腎癌等腫瘤的病理過(guò)程有關(guān)[5]。YE等[6]研究認(rèn)為miRNA-145的甲基化程度與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后直接相關(guān)，其在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。此外，miRNA-145已被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌的鱗癌和腺癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，并且與腫瘤的臨床分期緊密相關(guān)[7]。SUI等[4]的研究則印證了外周循環(huán)中miRNA-145表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中的作用。他們發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者血清miRNA-145的表達(dá)明顯低于對(duì)照組，且miRNA-145對(duì)非小細(xì)胞肺癌的診斷具有良好的敏感度和特異度。本研究采用RT-PCR技術(shù)對(duì)55例非小細(xì)胞肺癌患者的研究顯示復(fù)發(fā)組患者血漿miRNA-145的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，進(jìn)一步的分析顯示未復(fù)發(fā)組血漿miRNA-145的表達(dá)明顯增加。提示miRNA-145的表達(dá)上調(diào)可能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并且促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌治療的進(jìn)展。

miRNA-221在非小細(xì)胞肺癌中的作用也已被證實(shí)。研究表明miRNA-221在非小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)組的異常率為61.1%，上調(diào)miRNA-221表達(dá)可以促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌NCI-H1299細(xì)胞株的生長(zhǎng)，而下調(diào)miRNA-221 表達(dá)則導(dǎo)致了這種能力的降低[8]。王峰等[9]分析153例非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，miRNA-221表達(dá)與患者年齡、臨床分期存在明顯相關(guān)性。多因素COX回歸分析顯示，臨床分期和miRNA-221表達(dá)是影響患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，miRNA-221的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者總生存期的縮短有關(guān)。miRNA-221在NSCLC療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用也被證實(shí)。有研究納入184例非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對(duì)象，分析其術(shù)后復(fù)發(fā)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組血清miRNA-221表達(dá)水平及表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)組[10]。本研究采用RT-PCR技術(shù)分析非小細(xì)胞肺癌患者的療效結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)組血漿miRNA-221表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而未復(fù)發(fā)組miRNA-221表達(dá)則明顯降低，提示調(diào)節(jié)miRNA-221表達(dá)可能影響非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后。

研究表明非小細(xì)胞肺癌患者血清CEA和CYSRA21-1水平明顯增高，且隨非小細(xì)胞肺癌病理TNM分期的遞增而逐漸增高[1]。檢測(cè)血清CEA和CYSRA21-1水平可以監(jiān)測(cè)非小細(xì)胞肺癌術(shù)后的復(fù)發(fā)[11]。本研究結(jié)果顯示未復(fù)發(fā)組CEA和CYSRA21-1水平高于對(duì)照組，而低于復(fù)發(fā)組。這些結(jié)果印證了非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)的療效，同時(shí)又能提示非小細(xì)胞肺癌的復(fù)發(fā)。相關(guān)性分析顯示復(fù)發(fā)組血漿miRNA-145和miRNA-221表達(dá)分別與CEA和CYSRA21-1具有顯著相關(guān)性。非小細(xì)胞肺癌患者病理特征的分析顯示miRNA-145和miRNA-221表達(dá)與TNM分期和病理類型有顯著相關(guān)性。以上提示miRNA-145和miRNA-221可能參與非小細(xì)胞肺癌的病變進(jìn)展，兩標(biāo)志物的差異表達(dá)可提示非小細(xì)胞肺癌術(shù)后的復(fù)發(fā)狀況。

總之，隨著對(duì)非小細(xì)胞肺癌分子生物學(xué)研究的深入，基于腫瘤標(biāo)志物的診斷及預(yù)后研究將會(huì)有著越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)，有關(guān)惡性腫瘤新的分子標(biāo)志物的研究和發(fā)現(xiàn)將可能會(huì)改變臨床診治的策略和流程。