外周血T細(xì)胞受體刪除環(huán)(TRECs)定量測(cè)定在評(píng)估骨髓移植術(shù)后免疫重建中的應(yīng)用概況及進(jìn)展*

武小亮，韓 娟，王 靖，盧林綱

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食物與營(yíng)養(yǎng)發(fā)展研究所評(píng)價(jià)研究室，北京 100081)

胸腺是人體重要的中樞免疫器官，是T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和成熟的重要場(chǎng)所[1]。來自骨髓中的前T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育形成naive T細(xì)胞，隨血流運(yùn)輸至外周血發(fā)揮免疫作用。胸腺naive T細(xì)胞的輸出能力，一定程度上反映了機(jī)體的免疫水平。研究表明，胸腺輸出功能與年齡呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，隨著年齡的增長(zhǎng)胸腺逐漸萎縮，胸腺輸出功能逐漸降低，但還是能夠維持最基本的輸出naive T細(xì)胞的能力并對(duì)機(jī)體發(fā)揮免疫作用[2-3]。除年齡增長(zhǎng)所引起胸腺萎縮及輸出功能下降外，HIV，CHB，AIDs，白血病等病毒和疾病，臨床中的化療、放療、骨髓移植、實(shí)體器官移植、免疫治療，或長(zhǎng)期接觸有害化學(xué)物質(zhì)如苯等，均會(huì)引起胸腺輸出功能降低[4-6]。

骨髓移植是治療白血病、多發(fā)性淋巴瘤等惡性血液病及免疫系統(tǒng)疾病的有效治療手段[7-8]。骨髓移植后T細(xì)胞免疫功能的重建，部分依賴于胸腺途徑所產(chǎn)生并輸出的naive T細(xì)胞。目前，T細(xì)胞受體刪除環(huán)(T-cell receptor excision circle，TRECs)是naive T細(xì)胞含量水平的標(biāo)志[9-11]。DOUEK等[12-13]于1998年在《Nature》上首次報(bào)道TRECs，明確了TRECs的水平能夠代表胸腺近期所輸出的naive T細(xì)胞的數(shù)量，隨后應(yīng)用于臨床研究和指標(biāo)檢測(cè)中，HIV感染及AIDs患者常利用TRECs來評(píng)價(jià)胸腺功能；2000年開始TRECs被用于骨髓移植后免疫重建的分析評(píng)價(jià)。T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起核心作用[14]，T細(xì)胞數(shù)量及功能的重建狀況是移植成功的關(guān)鍵，同時(shí)也是移植后重點(diǎn)監(jiān)視的重要臨床指標(biāo)之一。骨髓移植后免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期的缺陷，患者可能會(huì)面臨由機(jī)會(huì)性感染或復(fù)發(fā)所引起的較高風(fēng)險(xiǎn)的死亡率。因此，利用合適的方法來監(jiān)測(cè)T細(xì)胞的重建情況，及時(shí)反映機(jī)體免疫狀況，為評(píng)價(jià)移植后患者免疫系統(tǒng)重建狀況提供可靠的信息，有助于醫(yī)護(hù)人員制定更加有效的治療策略。鑒于TRECs是評(píng)價(jià)胸腺近期輸出功能和naive T 細(xì)胞數(shù)量的重要指標(biāo)，能夠反應(yīng)機(jī)體免疫功能狀況。本文就近年來外周血T細(xì)胞受體刪除環(huán)(TRECs)的定量測(cè)定及其在骨髓移植后免疫重建中的應(yīng)用概況及進(jìn)展作一綜述。

1 TRECs形成機(jī)理前T細(xì)胞由骨髓遷至胸腺，在胸腺中發(fā)育后，最終形成具有多樣化T細(xì)胞表面抗原受體(TCR)的成熟T細(xì)胞被釋放到外周。TCR包括α，β，γ和δ四種，以異二聚體αβTCR和γδTCR的形式存在。胸腺中來源于骨髓的前T細(xì)胞的TCR基因處于無功能表達(dá)的胚系狀態(tài)，由V，J，(D)和C區(qū)組成。不同區(qū)域的片段在重組信號(hào)序列(RSS)的識(shí)別及介導(dǎo)下發(fā)生隨機(jī)重排，形成具有編碼功能的V-(D)-J序列[15]。每個(gè)功能性TCR基因的形成都會(huì)刪除RSS之間的序列所形成的環(huán)狀DNA[16-17]，即T細(xì)胞受體刪除環(huán)(T cell receptor excision circles)或信號(hào)結(jié)合T細(xì)胞受體刪除環(huán)(sjTRECs)，約70%αβT細(xì)胞以這種重排方式重排。外周血中的T細(xì)胞95%以上是αβT細(xì)胞[18-19]，TCRα基因重排是αβT細(xì)胞形成的首要步驟，由于TCRδ和TCRα兩個(gè)基因特殊的位置關(guān)系，因此，TCRα基因發(fā)生重排時(shí)的首要步驟是刪除TCRδ基因[12，20]。TRECs作為染色體外的環(huán)形副產(chǎn)物穩(wěn)定地存在于細(xì)胞中，其含量不受細(xì)胞分裂的影響，但會(huì)受到細(xì)胞擴(kuò)增的影響而被逐漸稀釋[16-17，21-24]。

2 TRECs代表的含義TRECs的形成原理決定了只有naive T細(xì)胞中含有T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)[17]，由于其在細(xì)胞中非常穩(wěn)定，不隨細(xì)胞的分裂而復(fù)制，但隨著細(xì)胞的擴(kuò)增而逐漸被稀釋，其含量始終代表了naive T細(xì)胞的含量。因此，TRECs的含量可以用來表示功能性TCR基因形成時(shí)初始T細(xì)胞，即naive T細(xì)胞的含量[12]。naive T細(xì)胞能夠識(shí)別環(huán)境中所有抗原并與之發(fā)生反應(yīng)，其含量反應(yīng)了胸腺產(chǎn)生和輸出T細(xì)胞的能力，因此TRECs的含量可用來真實(shí)地反映胸腺近期輸出naive T細(xì)胞的數(shù)量和胸腺近期的功能狀態(tài)，進(jìn)而體現(xiàn)機(jī)體的免疫能力狀態(tài)[12，16，18，22-24]。TRECs自1998年報(bào)道以來，逐漸成為評(píng)價(jià)胸腺近期輸出naive T細(xì)胞能力的重要指標(biāo)，2000年開始用于評(píng)價(jià)骨髓移植后免疫重建狀況[12-13]。直至今日，TRECs依然是評(píng)價(jià)骨髓移植后免疫重建狀況重要的指標(biāo)之一，被廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。

3 TRECs的測(cè)定方法概述TRECs的定量方法主要有PCR-ELISA，QC-PCR及RT-PCR。其中RT-PCR最為敏感和準(zhǔn)確，也是目前應(yīng)用最為廣泛的方法。此方法首先需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，然后將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋成7個(gè)濃度梯度，常利用Taqman探針RT-PCR進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品7個(gè)濃度的RT-PCR后得到的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到待測(cè)樣品中目的基因TRECs和內(nèi)參基因RAG2的絕對(duì)拷貝數(shù)值；根據(jù)RAG2基因在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)2個(gè)拷貝來確定待測(cè)樣品的細(xì)胞數(shù)量，然后計(jì)算TRECs的拷貝數(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中時(shí)常以1 000個(gè)細(xì)胞中含有TRECs的拷貝數(shù)來反映naive T細(xì)胞的含量。計(jì)算公式為：1 000個(gè)細(xì)胞中TRECs拷貝數(shù)=2×1 000×∑TRECs/∑RAG2[19，25-26]。另外，也可以根據(jù)樣品中基因組DNA中目的基因TRECs和內(nèi)參基因RAG2的PCR擴(kuò)增的Ct值反映拷貝數(shù)，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)2-ΔΔCt求得目的基因TRECs相對(duì)于內(nèi)參基因RAG2的相對(duì)表達(dá)量，即使用RQ值進(jìn)行比較分析[27-28]。

4 TRECs在評(píng)估移植后免疫重建中的應(yīng)用骨髓移植成功的關(guān)鍵取決于移植后免疫系統(tǒng)的重建狀況。因此，臨床中免疫重建狀況的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，尤其對(duì)早期的免疫重建的檢測(cè)是一項(xiàng)十分重要的工作。以及時(shí)對(duì)患者進(jìn)行合理的干預(yù)，有效改善預(yù)后，提高長(zhǎng)期無病生存率。而TRECs作為naive T細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，是評(píng)價(jià)早期T細(xì)胞重建和胸腺近期輸出功能的重要指標(biāo)，能夠反映移植后患者的免疫功能狀態(tài)。

4.1 骨髓移植后免疫重建的評(píng)價(jià) 骨髓移植是治療惡性血液病及免疫系統(tǒng)疾病的有效治療手段[7-8]，骨髓移植的成功與否很大程度上取決于免疫系統(tǒng)的重建能力，而T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中起核心作用[14]，因此，T細(xì)胞的重建是整個(gè)免疫系統(tǒng)重建中至關(guān)重要的部分。骨髓移植后T細(xì)胞的重建主要依靠?jī)蓚€(gè)途徑，一是胸腺依賴途徑，即來自供體的前T細(xì)胞在胸腺中發(fā)育；二是非胸腺依賴途徑，即供體來源的成熟T細(xì)胞的外周擴(kuò)增[29-30]。

骨髓移植后的1～2個(gè)月表型成熟的T細(xì)胞逐漸恢復(fù)，這主要顯示了供體來源的成熟T細(xì)胞的外周擴(kuò)增。通過檢測(cè)此條途徑的T細(xì)胞恢復(fù)情況，顯然存在不足之處。一方面，成熟T細(xì)胞的外周擴(kuò)增產(chǎn)生的T細(xì)胞不足以維持足夠數(shù)量的穩(wěn)定T細(xì)胞群[25]，在淋巴細(xì)胞衰竭情況下，這種成熟T細(xì)胞的外周擴(kuò)增具有偏向性，幼稚性T細(xì)胞增殖能力相比記憶性T細(xì)胞弱[31]，記憶性T細(xì)胞由于缺乏對(duì)新抗原的反應(yīng)性，因此難以抵抗移植后感染性病毒等各種抗原的侵襲[25]；另一方面，不能了解依賴胸腺途徑所產(chǎn)生并輸出的naive T 細(xì)胞的情況，忽略了患者持久的免疫重建能力和后備能力[31]。顯然，測(cè)定骨髓移植后表型成熟的T細(xì)胞的恢復(fù)不能真實(shí)地反映免疫重建狀況。

評(píng)估骨髓移植后免疫重建狀況常常利用naive T細(xì)胞的表型，即依賴胸腺途徑發(fā)育并輸出的naive T細(xì)胞的重建能力，來說明并評(píng)估胸腺近期的輸出功能情況。但僅通過借助流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)具有初始表型的T細(xì)胞的數(shù)量來評(píng)估T細(xì)胞重建能力具有一定的局限性。因?yàn)榧?xì)胞從胸腺輸出后，CD45RA+naive T細(xì)胞靜止期較長(zhǎng)，可自發(fā)增殖或轉(zhuǎn)變成CD45RO+記憶或效應(yīng)T細(xì)胞；某些情況下表達(dá)初始細(xì)胞表型的細(xì)胞不一定是naive T細(xì)胞，如記憶性CD8+T細(xì)胞同樣會(huì)表達(dá)初始細(xì)胞表型[19]。另外，naive T細(xì)胞可能來源于T細(xì)胞亞群的外周擴(kuò)增、淋巴組織中T細(xì)胞的釋放或是記憶或效應(yīng)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，這些不確定因素的存在限制了單純利用naive T細(xì)胞的免疫表型來評(píng)估胸腺近期輸出功能。目前，評(píng)價(jià)骨髓移植后患者持久的T細(xì)胞免疫重建和胸腺近期輸出功能狀況的公認(rèn)方法是檢測(cè)胸腺近期輸出的naive T細(xì)胞數(shù)量[32]。TRECs作為naive T細(xì)胞的分子標(biāo)志，穩(wěn)定地存在于細(xì)胞中，不隨T細(xì)胞的增殖而擴(kuò)增，只隨T細(xì)胞的分裂而被逐漸稀釋，其含量始終代表了胸腺近期輸出naive T細(xì)胞的含量[12，33]。

因此，利用外周血中TRECs的水平來反應(yīng)胸腺近期輸出naive T細(xì)胞的數(shù)量和胸腺近期輸出功能，對(duì)骨髓移植后患者免疫重建狀況的監(jiān)測(cè)及預(yù)后發(fā)展具有重要意義。

4.2 TRECs作為判斷移植后免疫重建的指標(biāo) 國(guó)內(nèi)外大量研究表明，TRECs常用于評(píng)價(jià)骨髓移植后患者胸腺近期輸出功能，以反映患者真實(shí)的免疫重建狀況[19，25，28]。通過外周血TRECs的定量分析，進(jìn)一步提升了對(duì)免疫重建狀況的確切判斷。TRECs水平受多種因素影響，包括造血干細(xì)胞移植方式、急慢性移植物抗宿主病、患者年齡、移植前的預(yù)處理?xiàng)l件等[13]。骨髓移植后依賴胸腺途徑的T細(xì)胞免疫重建相對(duì)較晚[34]，孫麗華等[25]利用熒光定量PCR方法定量檢測(cè)骨髓移植后患者外周血TRECs的水平，發(fā)現(xiàn)移植后1～6個(gè)月內(nèi)TRECs水平處于較低狀態(tài)，之后逐漸升高，移植后1.5年恢復(fù)至移植前水平，直到移植后2.5年才可基本恢復(fù)正常水平。骨髓移植后外周血T細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)較快，但胸腺功能恢復(fù)相對(duì)緩慢，一般情況下，外周血T細(xì)胞數(shù)量達(dá)到正常后，胸腺功能至少需要經(jīng)歷6個(gè)月才能恢復(fù)[34]。

骨髓移植后胸腺功能恢復(fù)緩慢，這可能會(huì)導(dǎo)致患者長(zhǎng)期的T細(xì)胞免疫功能低下，是移植后引發(fā)感染和復(fù)發(fā)的根本原因。國(guó)內(nèi)外研究表明，TRECs的水平與年齡呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)[30，35-36]，這可能跟胸腺隨年齡增長(zhǎng)而逐漸萎縮有關(guān)，因此，骨髓移植后年齡較小者免疫重建恢復(fù)能力會(huì)更快[37]。移植物抗宿主病(GVHD)是骨髓移植后常出現(xiàn)的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生GVHD的患者TRECs水平較未發(fā)生GVHD的患者低，且此效應(yīng)長(zhǎng)期存在，經(jīng)過免疫治療后TRECs的含量會(huì)有所上升[30，38]，表明機(jī)體免疫狀況得到了改善。利用外周血TRECs的水平證明了非清髓性移植的胸腺功能恢復(fù)較清髓性移植的快，非清髓性移植后12個(gè)月可在外周血中檢測(cè)到TRECs，而清髓性移植TRECs的含量在移植后18～24個(gè)月時(shí)才能被檢測(cè)到[39]。清髓性移植對(duì)患者胸腺造成了巨大損傷，導(dǎo)致胸腺功能降低且恢復(fù)緩慢，保護(hù)移植前預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)胸腺造成的損傷及加快移植后胸腺損傷修復(fù)，對(duì)移植后免疫系統(tǒng)重建具有十分重要的意義。通過定量外周血TRECS的含量，在反映患者真實(shí)免疫重建狀況及胸腺功能的同時(shí)，有助于醫(yī)務(wù)工作者及時(shí)了解患者近期胸腺輸出功能，以判斷患者免疫功能狀況，為患者制定更加合理的治療策略。

4.3 TRECs作為移植后療效評(píng)價(jià)指標(biāo) 骨髓移植后常由于免疫重建緩慢，特別是T細(xì)胞的長(zhǎng)期缺陷，導(dǎo)致患者面臨著由復(fù)發(fā)或感染所引起的較高風(fēng)險(xiǎn)的死亡率[40-43]。利用合理的治療策略加快骨髓移植后機(jī)體免疫恢復(fù)成為目前研究的熱點(diǎn)。TRECs作為胸腺近期輸出功能的評(píng)判指標(biāo)，常用于對(duì)相應(yīng)治療策略療效的評(píng)價(jià)。XU等[28]通過定量小鼠外周血TRECs的水平，證明了骨髓移植預(yù)處理?xiàng)l件之前Ghrelin的管理，能夠顯著提高骨髓移植后小鼠胸腺輸出功能的重建并促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的恢復(fù)。該研究提示，Ghrelin可能作為一種胸腺生長(zhǎng)因子加快骨髓移植后免疫功能重建。HOCHBERG等[34]對(duì)骨髓移植后6個(gè)月的患者進(jìn)行了供者CD4+T淋巴細(xì)胞的輸注，通過定量TRECs發(fā)現(xiàn)其水平得到了提高，證明了供者淋巴細(xì)胞輸注對(duì)患者免疫重建作用的意義。鋅是人體必需的微量元素之一，大劑量口服鋅補(bǔ)充劑可以提高骨髓移植后患者CD4+naive T細(xì)胞含量，TRECs定量結(jié)果顯示，口服高劑量鋅的患者TRECs水平明顯提高，指出鋅能夠加快骨髓移植后患者免疫重建及胸腺功能恢復(fù)，有望在臨床中應(yīng)用以促進(jìn)骨髓移植后患者的免疫重建[44]，同時(shí)也再次說明了TRECs在骨髓移植后用于療效評(píng)價(jià)的重要作用。相信在未來的研究中TRECs依然會(huì)得到廣泛的應(yīng)用，尤期是對(duì)免疫系統(tǒng)重建狀況的評(píng)價(jià)及相關(guān)治療策略和藥物的篩選，以更加精準(zhǔn)地評(píng)估患者免疫系統(tǒng)狀態(tài)和相關(guān)藥物的治療效果。

5結(jié)語(yǔ)TRECs的含量始終代表了naive T細(xì)胞的含量，且每個(gè)naive T細(xì)胞中含有兩個(gè)TRECs。通過定量檢測(cè)TRECs的含量，來間接反映胸腺近期輸出naive T的能力，作為判斷骨髓移植后胸腺功能恢復(fù)及免疫重建狀況的重要指標(biāo)。但也存在一些不足之處，包括T細(xì)胞的凋亡和外周分裂；形成功能性TCR基因時(shí)δRec-ψJα-sjTRECs的刪除方式占70%左右，其他刪除方式可能存在影響；機(jī)體外周長(zhǎng)期存在的TRECs影響對(duì)近期胸腺的輸出功能的準(zhǔn)確判斷；部分TRECs其半衰期較長(zhǎng)可能會(huì)對(duì)胸腺近期輸出功能產(chǎn)生誤判[39-41]。盡管如此，目前尚未發(fā)現(xiàn)比TRECs更為可靠的指標(biāo)來指示免疫系統(tǒng)重建和恢復(fù)狀況，因此TRECS的定量分析依然作為判斷胸腺近期輸出功能的主要方法。由于該方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，使其成為監(jiān)測(cè)骨髓移植后患者免疫重建狀況的可靠依據(jù)[38]。在今后的應(yīng)用及研究過程中，應(yīng)該注意定量TRECs評(píng)價(jià)胸腺近期輸出功能所存在不足之處，在力爭(zhēng)闡明這些因素所產(chǎn)生的不同影響的同時(shí)，對(duì)患者近期胸腺輸出功能做出更加客觀和準(zhǔn)確的判斷。