金感膠囊微生物限度檢查方法適用性研究

滕 鈺 徐 洪 周映佑 羅 曼 薛詠蘭 黃 婕 王 俊

貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽(yáng) 550004

藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施[1]。藥品一旦受到微生物污染，將造成藥品變質(zhì)、成分分解失效甚至產(chǎn)生毒素，引起疾病、威脅生命[2]。微生物限度檢查不僅能正確地反映藥品企業(yè)生產(chǎn)工藝及處方比例的合理性及科學(xué)性，也是保證藥品質(zhì)量的重要手段[3]。

金感膠囊為獨(dú)家生產(chǎn)品種，處方組成為金銀花、穿心蓮、板藍(lán)根、蒲公英、對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸金剛烷胺、馬來(lái)酸氯苯那敏，具有清熱解毒，疏風(fēng)解表的功效[4]。目前還未見(jiàn)相應(yīng)微生物限度檢查方法的報(bào)道。本文按《中國(guó)藥典》要求，依照品種特性，建立了適宜的微生物檢查方法，以補(bǔ)充該品種的在微生物質(zhì)量控制方面的空缺。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1300生物安全柜(賽默飛世爾)；ME2002電子天平(梅特勒-托利多)；KB240低溫培養(yǎng)箱(BINDER)；BF240恒溫培養(yǎng)箱(BINDER)；DK-98-ⅡA水浴鍋(天津泰斯特)。

1.2 樣品 金感膠囊(批號(hào)：20161104、20161116、20170619，貴州百靈企業(yè)集團(tuán)制藥股份有限公司)。

1.3 菌種 黑曲霉(CMCC(F)98003)、白色念珠菌(CMCC(F)98001)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、銅綠假單胞菌(CMCC(B)10104)、枯草芽孢桿菌(CMCC(B)63501)、大腸埃希菌(CMCC(B)44102)等均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1604055)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA(批號(hào)：18042762)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA(批號(hào)：18010864)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB(批號(hào)：18073161)等購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB(批號(hào)：18030915)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號(hào)：20180828)等購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備 取“1.3”項(xiàng)下菌種，按2015年版《中國(guó)藥典》四部通則1105、1106“菌液制備”項(xiàng)下進(jìn)行[5]。

2.2 供試液制備 稱(chēng)取批號(hào)為20161104的樣品10 g，加入TSB至100 mL，40℃水浴保溫混勻，即得1∶10供試液。取3份稀釋倍數(shù)為1∶10供試液(10 mL)，分別加入TSB至50 mL、80 mL、100 mL，即得1∶50、1∶80、1∶100稀釋倍數(shù)供試液。

2.3 預(yù)試驗(yàn)

2.3.1 計(jì)數(shù)方法[5]試驗(yàn)組：取1∶10、1∶50、1∶80、1∶100供試液，分別加入“2.1”項(xiàng)下制備的黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌，混合，使得每mL供試液中對(duì)應(yīng)菌濃度不大于100 cfu。分別取1 mL上述黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌與供試液混合液平行注皿，傾注20 mL TSA，33 ℃培養(yǎng)3 d計(jì)數(shù)；分別取1 mL上述黑曲霉、白色念珠菌與供試液混合液平行注皿，傾注20 mL SDA，23 ℃培養(yǎng)5 d計(jì)數(shù)。供試液對(duì)照組：不加菌液，其余按“試驗(yàn)組”制備菌液組：不加供試液，其余按“試驗(yàn)組”進(jìn)行?；厥毡戎?(試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù))/菌液對(duì)照組，其范圍應(yīng)為0.5～2。

2.3.2 計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 按“2.3.1”操作所得結(jié)果如表1所示，表明該品種對(duì)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌有抑制作用。其中抑制白色念珠菌的生長(zhǎng)較明顯：當(dāng)供試液稀釋倍數(shù)為1：50時(shí)，白色念珠菌在TSA和SDA培養(yǎng)基上的回收比值均小于0.5，不符合《中國(guó)藥典》規(guī)定；當(dāng)需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)環(huán)節(jié)的供試液稀釋倍數(shù)分別為1∶100、1∶80時(shí)，白色念珠菌的回收比值為0.73、0.91，能夠達(dá)到藥典要求，故選擇上述稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式試驗(yàn)。

表1 金感膠囊計(jì)數(shù)方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 控制菌檢查方法[5]取10 mL 1∶10供試液，分別接種至100 mL、150 mL、200 mL TSB中，加入不大于100 cfu的大腸埃希菌，混勻，33 ℃培養(yǎng)18 h。取1 mL培養(yǎng)物至100 mL麥康凱液體中，43 ℃培養(yǎng)24 h后劃線(xiàn)接種于麥康凱瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)18 h，以上即為試驗(yàn)組。同法制備陽(yáng)性對(duì)照組，對(duì)比觀察菌落形態(tài)。

2.3.4 控制菌檢查方法預(yù)試驗(yàn)結(jié)果 由表2可知，方法適用性試驗(yàn)的所有體積均能檢出相應(yīng)陽(yáng)性菌，故選擇TSB 100 mL作為正式試驗(yàn)TSB培養(yǎng)基體積。

表2 金感膠囊控制菌檢查預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示有典型菌落生長(zhǎng)

2.4 正式試驗(yàn)

2.4.1 計(jì)數(shù)方法 需氧菌、霉菌和酵母總數(shù)計(jì)數(shù)分別采用1∶100供試液、1∶80供試液，按“2.3”項(xiàng)下操作進(jìn)行。由表3可知，回收比值均大于0.5，符合藥典規(guī)定。

2.4.2 控制菌檢查[5]以TSB培養(yǎng)基體積 100 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下操作，即得試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組。另取10 mL 1∶10供試液，接種至100 m TSB中，混勻，33 ℃培養(yǎng)24 h。取1 mL培養(yǎng)物至100 mL麥康凱液體中，43 ℃培養(yǎng)48 h后劃線(xiàn)接種于麥康凱瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)72 h，即得供試品對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后，試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組均檢出大腸埃希菌，供試品對(duì)照組未檢出大腸埃希菌。

表3 金感膠囊計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

研究中，霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)供試液稀釋倍數(shù)小于需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)的，但其對(duì)應(yīng)的白色念珠菌回收比值高于需氧菌計(jì)數(shù)環(huán)節(jié)，且差別較大。除去培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間的原因外，可能還與培養(yǎng)基差別有關(guān)。資料顯示，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中葡萄糖含量高、pH值5.6左右，有利于霉菌和酵母菌的檢出[6]。經(jīng)測(cè)，本研究所涉及的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基滅菌后pH值分別為7.29、5.57，與解慧等[7]的研究數(shù)據(jù)接近。而白色念珠菌最適生長(zhǎng)pH為5.0左右[8]，因此沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的pH值更適合白色念珠菌生長(zhǎng)。

另外，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的氮源是動(dòng)物組織胃蛋白酶水解物和胰酪胨等量混合物，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中氮源為胰酪胨、大豆木瓜蛋白酶水解物。兩者氮源類(lèi)別的區(qū)別在于前者配方中是動(dòng)物性蛋白質(zhì)來(lái)源水解物，后者則為植物性蛋白質(zhì)來(lái)源水解物；植物性蛋白質(zhì)如大豆的水解物往往會(huì)缺少某些微生物必需的氨基酸[9]。這可能是白色念珠菌在胰酪大豆胨瓊脂上回收比值更低的原因。

微生物限度檢查方法直接影響檢驗(yàn)結(jié)果及藥品評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性[10]。建立微生物限度檢查方法時(shí)，要考慮藥品所含成分的抑菌性[11]。金感膠囊的特殊之處在于其處方中既有中藥成分，也有西藥成分。品種成分中，除了有金銀花會(huì)抑制白色念珠菌的明確報(bào)道外[12]，馬來(lái)酸氯苯那敏成分可能會(huì)降低白色念珠菌的回收比值[13]，此外未見(jiàn)關(guān)于其它組分抑菌性的報(bào)道；但本研究發(fā)現(xiàn)樣品會(huì)對(duì)枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，并不能明確是何種組分造成的影響，因此可對(duì)其它組分的抑菌性進(jìn)行進(jìn)一步研究。