HPLC法對不同產(chǎn)地骨碎補習(xí)用品柚皮苷的含量測定

1.昆藥集團股份有限公司藥物研究院，云南 昆明 650100；2.云南大學(xué)教育部自然資源藥物化學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650091

柚皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

骨碎補是水龍骨科植物槲蕨Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.的干燥根莖，為我國常用中藥。其可療傷止痛、補腎強骨，外用亦可消風(fēng)祛斑；臨床上主要用于跌撲損傷、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、耳鳴耳聾、牙齒松動等，外治斑禿和白癜風(fēng)等[1]。 除2015年版《中國藥典》收載的骨碎補外，歷代文獻中記載的骨碎補習(xí)用品有來源于3個科6個屬的10余種藥用植物[2]。目前從骨碎補中分離所得的化學(xué)成分主要涉及黃酮、三萜、酚酸及其的苷類等[3]，現(xiàn)行的藥典規(guī)定用高效液相色譜法測定其中主要成分柚皮苷的含量以控制其質(zhì)量[1]。本課題通過對比不同文獻與藥典記載的提取方法及實驗結(jié)果，選用微波提取法和具有創(chuàng)新性的實驗型閃式提取器在不同實驗條件下對同一種類骨碎補進行有效成分的提取，并對提取效率進行對比；同時對五種不同品種的骨碎補通過提取器經(jīng)相同條件提取其中有效成分，進行柚皮苷含量大小的比較，旨在為骨碎補藥材的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-Agilent 1100型高效液相色譜儀；中草藥粉碎機(FW135)；實驗型閃式提取器(JHBE-50V)；ME204E/02電子天平；KQ-5200B超聲儀；XH-100A微波催化合成/萃取儀；甲醇為色譜純(Fisher)，乙腈為色譜純(Fisher)，甲酸為分析純，水為二次重蒸水。

1.2 材料 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司(純度≥98%)；骨碎補藥材由云南中醫(yī)藥大學(xué)提供，藥材均由云南中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院尹子麗老師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗[1-2]以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9 mL/min；溫度：室溫；檢測波長：283 nm，理論板數(shù)按柚皮苷峰計算應(yīng)不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品6.3 mg，用甲醇溶解并于100 mL量瓶中定容，制成63.0 μg/mL的柚皮苷溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 微波法[4]選取一種骨碎補樣品(鱗軸小膜蓋)，用粉碎機粉碎3次，每次10 s。稱取藥材粗粉約0.50 g，精密稱定，置于三口燒瓶中。根據(jù)文獻和實際操作，加入甲醇∶水=2∶1的甲醇水溶液150 mL，微波協(xié)助提取70 ℃，保溫8 min(每分鐘暫停攪拌一下以保證有效成分充分溶解)，取出，冷卻至室溫，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

2.3.2 提取器提取法一 將骨碎補習(xí)用品用粉碎機粉碎3次，每次10 s。稱取藥材粗粉約10.00 g，精密稱定，于小燒杯中待用，精密加入分析純甲醇(≥99.8%)2 L于提取桶，倒入先前已精密稱定的藥材粗粉，開啟提取器提取2 min，用注射器取下層清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

2.3.3 提取器提取法二 將骨碎補習(xí)用品用粉碎機粉碎3次，每次10 s。取其中一種藥材(鱗軸小膜蓋)的粗粉約10.00 g，精密稱定，于小燒杯中待用，精密加入甲醇1400 mL和蒸餾水700 mL于提取桶，攪拌使兩者混合均勻，再倒入先前備用的藥材粗粉，開啟機器提取2 min，用注射器取下層清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液。

比較方法2.3.2和2.3.3的提取效率大小，擇優(yōu)對其他品種藥材進行提取。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取柚皮苷對照品溶液2.5、3.5、5.0、7.5、10.0 μL依次進樣，測定峰面積。以柚皮苷質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進行線性回歸得回歸方程為：y=1.6505×109x+62.03，R2=0.9958。結(jié)果表明柚皮苷進樣量在157.5～472.5ng范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗 精密吸取同一供試品溶液(鱗軸小膜蓋)10 μL，在2.1色譜條件下進行測定，測得柚皮苷峰面積RSD0.08%(n=3)，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一對照品溶液5 μL，分別間隔0、18、24h，在2.1色譜條件下進行測定，測得柚皮苷峰面積RSD1.00%，表明柚皮苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性實驗 對同一批骨碎補藥材(鱗軸小膜蓋)，按2.3.3供試品溶液的制備方法平行制備3份，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按2.1色譜條件進行測定并計算柚皮苷含量，RSD1.31%(n=3)，表明此法重復(fù)性良好。

2.8 樣品含量測定 取不同種類的骨碎補的樣品，按2.3確定的方法分別依法制備，分別精密吸取供試品各10 μL，注入液相色譜儀，測定柚皮苷的含量。結(jié)果表明所測定的5種樣品中，柚皮苷的含量差異較大，且兩種提取方法的提取效率不同。見表1和表2。

表1 同一骨碎補樣品(鱗軸小膜蓋)用不同方法提取柚皮苷的含量 (n=3)

(注：提取器提取法1中溶劑是純甲醇；提取器提取法2中溶劑是甲醇水溶液(甲醇∶水=2∶1)。兩者其他條件均相同。)

表2 不同品種骨碎補樣品柚皮苷的含量

3 討論與結(jié)論

實驗采用高效液相色譜法測定不同來源的骨碎補藥材中有效成分柚皮苷的含量大小，對五個不同品種的骨碎補用新型的方法進行測定，并選擇其中一個品種改變方法和溶劑作為對照。測定結(jié)果表明：不同產(chǎn)地不同品種的柚皮苷含量差異較大，同一提取方法和操作步驟所得的鱗軸小膜蓋中柚皮苷的含量最高為0.0618 μg/g，中華槲蕨、石蓮姜槲蕨和團葉槲蕨中不含有柚皮苷；同種提取方法采用不同的溶劑提取也對測定結(jié)果有影響，即用提取器提取時，對于同一藥材的樣品，純甲醇作為溶劑時提得的柚皮苷含量比以66.7%的甲醇水作為溶劑提取得的柚皮苷含量高近一倍；不同的提取方式對于柚皮苷的提取效率亦有影響，根據(jù)方婧等人[4]的實驗結(jié)果和結(jié)論進行些許調(diào)整所采用的微波法提取測得的柚皮苷含量比用新式的實驗型閃式提取器提取同一批藥材所測得的柚皮苷含量高了一個數(shù)量級，為0.5663 μg/g，但該含量相較于其他文獻所記載的[2,4-6]仍較低。

2015年版《中國藥典》對骨碎補的含量測定項中規(guī)定[1]按干燥品計算，含柚皮苷(C27H32O14)不得少于0.50%。按規(guī)定，本實驗所測定的不同種類的骨碎補中柚皮苷含量均不合格，分析原因可能如下：實驗創(chuàng)新性地采用實驗型閃式提取器進行藥材有效成分柚皮苷的分離提取，該方法目前無文獻記載，故均按照其說明書上所寫每次每種藥材均提取2 min。通過對比測定所得的數(shù)據(jù)計算得的結(jié)果推測，藥材中的有效成分柚皮苷可能并沒有被完全提取出，由此導(dǎo)致最終測定得的柚皮苷含量較低，之后在該方面的實驗可改變提取器對藥材粉末進行提取的時間和溶劑組成進行研究。對中藥材的粉碎度大小對其中有效成分的浸出提取率亦可能有相當(dāng)影響，該方面也可作為一個研究方向進行后續(xù)的深入探究。此外，配置對照品溶液時是用小燒杯先精密稱量再進行定容，但小燒杯和樣品的質(zhì)量差異較大故產(chǎn)生的誤差也可能較大，從而影響標(biāo)準(zhǔn)曲線中峰面積相對應(yīng)的濃度的大小，進而對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

按文獻記載的微波法[4]提取所得的柚皮苷含量經(jīng)計算得的結(jié)果比文獻所記載的結(jié)果小了4個數(shù)量級，可能是受多方面因素影響的結(jié)果。文獻記載實驗中考察溶劑對提取效率的影響時發(fā)現(xiàn)50%甲醇的提取率最高，而本實驗中的溶劑是66.7%的甲醇；文獻考察提取溫度對柚皮苷提取效率的影響時發(fā)現(xiàn)120℃時提取率最高，而甲醇的沸點只有64.7℃，故本實驗實際操作時設(shè)置的微波溫度為70℃，可能會對提取結(jié)果產(chǎn)生影響；在保溫時間方面，文獻中得出的結(jié)論是柚皮苷在保留5 min后即已提取完全，故選定保留時間為5 min，而本實驗因為設(shè)定的提取溫度比文獻中使用的低，故相應(yīng)的延長對藥材粗粉的保溫時間至8 min，實驗操作者猜測該項對柚皮苷提取率的影響應(yīng)較小。此外，不同種類和產(chǎn)地的骨碎補本身所含的柚皮苷含量可能本身就差異很大且質(zhì)量參差，如中華槲蕨、石蓮姜槲蕨等甚至不含柚皮苷。同一來源品種藥材的干燥程度、取藥部位、藥材本身的質(zhì)量也可能對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

在用實驗2.1項下的色譜條件前，先采用了現(xiàn)行的2015版藥典中規(guī)定的用于骨碎補含量測定的色譜條件下的流動相，即甲醇-醋酸-水(35∶4∶65)[1]，但結(jié)果十分不理想。進行色譜條件的穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗時，連續(xù)進標(biāo)樣測得的保留時間由14.56 min逐漸延長至14.67 min，且24h后甚至延長至17.39 min，遠比大多數(shù)文獻[2,4,5]所寫的時間要久。此外，該流動相對于柚皮苷的響應(yīng)值較小，進樣量達10 μL時峰高也只有23.4，比文獻記載[4,6]的小了近一個數(shù)量級；而所出標(biāo)準(zhǔn)峰的對稱因子較大，進樣量僅7.5 μL時就已經(jīng)高達2.43；檢測來源于同一份提取液的第二三份供試品試液時甚至僅在3 min左右出現(xiàn)了一個雜峰，此外再無其他峰。按經(jīng)驗推測，該結(jié)果可能與流動相的酸性偏大及檢測時間較長已經(jīng)對液相柱造成一定壓力和損害有關(guān)。經(jīng)商討最終決定更換流動相成分再進行含量測定。

按前期的實驗操作[2]中的色譜條件更換流動相為乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)后，測定結(jié)果大大改觀，峰面積的響應(yīng)值與其他文獻記錄的相符，保留時間也相近，即在8 min左右出標(biāo)準(zhǔn)峰，且每次所出峰的對稱因子均小于1，色譜的穩(wěn)定性與重復(fù)性也較好。故本實驗最終采用乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)作為液相色譜的流動相。

由實驗結(jié)果可知，實驗型閃式提取器對骨碎補的提取率低于微波提取，可見該種方法還不能被廣泛應(yīng)用于對中藥材標(biāo)準(zhǔn)的含量測定，設(shè)定的提取時間、溫度和溶劑都還有改進提升效率的空間，這需要做進一步的實驗進行探究。此外，實驗雖未完全按照藥典規(guī)定的方法對骨碎補進行含量測定，但結(jié)果仍具有一定的參考價值。首先，藥典中的各檢測方法雖為國家規(guī)定的具有法律強制效力的標(biāo)準(zhǔn)，也有其不太合理的地方，比如本實驗中的流動相按藥典規(guī)定的比例配制，所得到的實驗結(jié)果十分不理想，當(dāng)然也可能與儀器性能跟不上有關(guān)。其次，藥典規(guī)定的提取方法操作較復(fù)雜，且提取時間過久，不利于質(zhì)檢所進行實操；且有效成分的提取率受多方面影響，不能保證檢測時有效成分已完全提取出，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的實行仍存在一定問題。