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    云南與新疆產(chǎn)分心木水提物急性毒性研究

    2019-08-20 07:11:08
    中國民族民間醫(yī)藥 2019年14期
    關(guān)鍵詞:生藥提物臟器

    1.大理大學(xué)藥物研究所,云南 大理 671000;2.楚雄醫(yī)藥高等??茖W(xué)校,云南 楚雄 675005

    分心木(DiaphragmaJuglandisFructus)為核桃(JuglansregiaL.)果實(shí)子房室的木質(zhì)中隔,也稱作胡桃衣、胡桃隔和核桃柵等[1-2]。臨床上主要用于治療遺精滑瀉、尿頻遺尿、崩漏、帶下、泄瀉和痢疾等病癥[3-4]。分心木化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn),其主要含有黃酮及其苷類成分、酚性化合物、有機(jī)酸、甾體、皂苷等[5-7]。值得注意的是,新疆分心木中含有大量木脂素類成分[8],此類成分在其他產(chǎn)地的分心木中尚未見有研究報道。近年來民間常將分心木用作保健品,用于對高血糖、高血脂等病癥的輔助治療與日常保健,但確切療效不是十分清楚。至于分心木使用的安全性,雖然《本草再新》等傳統(tǒng)中醫(yī)藥典籍中記載分心木“味苦澀,性平,無毒”,但尚未見有確切的分心木急性、慢性毒性方面的現(xiàn)代研究報道。為保證分心木使用安全,根據(jù)我國核桃分心木主要產(chǎn)地分布情況[9],筆者選取了云南大理和新疆喀什兩大核桃主產(chǎn)區(qū)的分心木水提物進(jìn)行急性毒性研究。

    1 材料與方法

    1.1 供試品 云南分心木2017年5月采自云南省大理州漾濞縣;新疆分心木2017年5月采自新疆喀什地區(qū)。分別稱取干燥云南分心木和新疆分心木,粉碎,過120目篩,加入蒸餾水于90(C回流,共提取三次,合并提取液,濃縮、凍干,分別得到云南分心木水提物和新疆分心木水提物凍干粉。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級昆明種小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量18 ~ 22 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2016-0002。小鼠分籠飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠中,室溫(21±2)℃。

    1.3 試劑 HE染液、乙腈和甲醇(色譜純),美國 Sigma公司;HP-20大孔樹脂,日本三菱公司;其余試劑均為分析純。

    1.4 儀器 小鼠獨(dú)立通氣籠(蘇州市蘇杭科技器材有限公司);ASP300S脫水機(jī)/RM2245切片機(jī)(德國萊卡公司);BMJ-C包埋機(jī)/PHY-III病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司);AP280-1冷凍臺(英國MICROM有限公司);CX41RF顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司);Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

    1.5 方法

    1.5.1 分心木水提物的LD50測定[10-11]經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定云南分心木引起小鼠全死的劑量LD100為28.4 g生藥/kg,全活的劑量LD0為9.28 g生藥/kg;新疆分心木引起小鼠全死的劑量LD100為17.04 g生藥/kg,全活的劑量LD0為6.43 g生藥/kg。為精確計算LD50,設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)分7個劑量組,計算得云南分心木相鄰兩組間的劑間比r=1.205,新疆分心木相鄰兩組間的劑間比r=1.177。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,取昆明種小鼠150只,雌雄各半,按體質(zhì)量隨機(jī)分為15組,每組10只,分別為正常對照組(不參與計算LD50,用于其他毒性指標(biāo)的比較)、云南分心木7個等比劑量組、新疆分心木7個等比劑量組。小鼠禁食不禁水16 h后灌胃不同劑量的兩種分心木,正常對照組灌胃蒸餾水,給藥體積為20 mL/kg,給藥后第1、4、10小時分別觀察1次,之后每天觀察1次,連續(xù)14 d。觀察期結(jié)束后,根據(jù)各組小鼠死亡數(shù),計算云南分心木和新疆分心木的LD50和95%置信區(qū)間。

    1.5.2 對小鼠體質(zhì)量和行為學(xué)的影響 在觀察期內(nèi),每天給小鼠定量喂食(3 g/只/d),每2天稱體質(zhì)量;每天觀察小鼠的運(yùn)動功能,有無驚厥等異常行為表現(xiàn)。

    1.5.3 對小鼠臟器指數(shù)和組織病理學(xué)的影響 將觀察期內(nèi)死亡小鼠和14 d后存活小鼠脫臼處死后的新鮮組織(心、肝、脾、肺、腎)分離,生理鹽水清洗后濾紙吸干,精確稱量各臟器質(zhì)量,根據(jù)體質(zhì)量計算臟器指數(shù) = 臟器質(zhì)量/體質(zhì)量 × 100%。然后將一部分臟器組織置于10%中性甲醛固定,常規(guī)脫水,包埋,切片后進(jìn)行HE染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察各臟器組織病理學(xué)變化。

    2 結(jié)果

    2.1 分心木水提物對小鼠體質(zhì)量的影響 與正常對照組相比,觀察期內(nèi),云南和新疆分心木水提物不同劑量組小鼠的體重變化均無顯著性差異。

    2.2 分心木水提物對小鼠行為學(xué)的影響 與正常對照組比較,給藥10 h內(nèi),除9.28 g生藥/kg的云南分心木和6.43 g生藥/kg的新疆分心木水提物組小鼠外,其他劑量組小鼠均出現(xiàn)活動減弱的行為;給藥48 h后,28.40 g生藥/kg的云南分心木和17.04 g生藥/kg的新疆分心木水提物組的小鼠活動依舊較少,其余各組小鼠行為學(xué)均無異常。

    2.3 分心木水提物的LD50測定 使用Bliss法計算,結(jié)果為云南分心木水提物的LD50為21.50 g生藥/kg,95%置信區(qū)間為17.56~32.84 g生藥/kg;新疆分心木水提物的LD50為12.40 g生藥/kg,95%置信區(qū)間為10.71~15.39 g生藥/kg。結(jié)果表明新疆分心木水提物對小鼠的致死毒性強(qiáng)于云南分心木。見表1。

    表1 云南分心木和新疆分心木水提物對小鼠死亡的影響

    2.4 分心木水提物對小鼠臟器指數(shù)的影響 由表2可知,與正常對照組對比,除13.47 g生藥/kg云南分心木水提物外,其他各劑量組小鼠的心臟指數(shù)降低,有極顯著性差異(P<0.01);28.40、23.57 g生藥/kg的云南分心木水提物組和14.48、12.31、10.46、8.89 g生藥/kg的新疆分心木水提物組小鼠的肝臟指數(shù)降低,有顯著性差異(P<0.01或P<0.05);除13.47 g生藥/kg的云南分心木水提物和17.04、14.48和10.46 g生藥/kg的新疆分心木水提物組外,其他劑量組小鼠的脾臟指數(shù)顯著降低(P<0.05);所有劑量組小鼠肺臟和腎臟的臟器指數(shù)無顯著變化。

    表2云南分心木和新疆分心木水提物對小鼠臟器指數(shù)的影響

    組別劑量/g/kg心臟指數(shù)肝臟指數(shù)脾臟指數(shù)肺臟指數(shù)腎臟指數(shù)正常對照0.56±0.054.41±0.510.17±0.010.70±0.081.15±0.1028.400.33±0.07??2.83±0.31?0.10±0.04?0.82±0.261.18±0.3623.570.36±0.12??2.28±0.45??0.10±0.04?0.75±0.361.02±0.24云南分心木19.560.30±0.12??3.34±0.470.11±0.07?0.72±0.201.02±0.1716.230.30±0.02??3.54±0.890.08±0.02??0.69±0.190.89±0.0713.470.44±0.143.19±0.640.12±0.040.90±0.021.29±0.4111.180.25±0.05??2.86±0.660.09±0.03?0.62±0.210.88±0.0517.040.40±0.05??4.55±0.500.15±0.070.84±0.271.23±0.2514.480.37±0.05??3.48±0.51?0.12±0.040.79±0.211.20±0.25新疆分心木12.310.36±0.07??3.13±0.47?0.10±0.07?0.72±0.181.19±0.1310.460.33±0.03??3.42±0.38?0.12±0.010.75±0.211.30±0.278.890.36±0.06??3.15±0.11?0.11±0.05?0.76±0.201.10±0.207.560.26±0.07??5.95±0.62?0.11±0.05?0.38±0.370.86±0.22

    注:與正常對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。

    2.5 分心木水提物對小鼠組織病理學(xué)的影響 由圖1可知,與正常對照組對比,28.40、23.57 g生藥/kg的云南分心木水提物和17.04、14.48 g生藥/kg的新疆分心木水提物會引起小鼠心肌纖維腫脹斷裂和心肌出現(xiàn)肌溶性壞死,心臟顆粒性變性。28.40、23.57、19.56 g生藥/kg的云南分心木水提物和17.04、14.48 g生藥/kg的新疆分心木水提物會引起肝臟細(xì)胞出現(xiàn)廣泛溶解壞死。所有云南分心木和新疆分心木劑量組小鼠的脾臟、肺臟和腎臟組織均未見明顯的病理變化。

    圖1 云南分心木和新疆分心木水提物對小鼠不同組織病理學(xué)的影響(HE,×400)

    3 討論

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,分心木并非完全無毒,云南和新疆分心木水提物劑量大于9.28 g生藥/kg和6.43 g生藥/kg時均可致昆明種小鼠出現(xiàn)死亡。兩種分心木的LD50表明新疆分心木水提物毒性強(qiáng)于云南分心木水提物。就毒性作用的靶器官而言,利用臟器指數(shù)進(jìn)行的初步評價結(jié)果表明,兩種分心木急性毒性的靶器官既有相似性又有所差別。相同的毒性靶器官為心臟,兩種分心木水提物幾乎所有劑量組的小鼠均出現(xiàn)了心臟指數(shù)的下降,這可能是分心木對心臟的作用有一定的選擇性,引起心肌細(xì)胞急性壞死甚至萎縮。兩種分心木對于肝臟和脾臟的毒性在程度上則有一定的區(qū)別,云南分心木主要在高濃度時表現(xiàn)肝臟和脾臟指數(shù)的下降,而新疆分心木在所有受試濃度均引起兩種臟器指數(shù)的下降,這可能是由于產(chǎn)地不同的兩種分心木在化學(xué)成分與相對含量上有所差異所致[8]。對可能毒性靶器官的病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示,兩種分心木水提物確實(shí)對心臟和肝臟產(chǎn)生了毒性作用,如引起心肌纖維斷裂和心肌壞死,以及肝臟細(xì)胞的溶解,結(jié)果進(jìn)一步明確了分心木的毒性靶器官和毒性類型。令人意外的是脾臟組織未見明顯病理變化,說明上述分心木引起的脾臟指數(shù)下降可能未產(chǎn)生可見的器質(zhì)性改變。

    另一方面,實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生毒性的最小劑量(6.43 g生藥/kg),標(biāo)準(zhǔn)體重成年人(60 kg)達(dá)到中毒劑量時需要分心木藥材用量約為312 g(按小鼠到人劑量換算系數(shù)0.081[11]和提取率10%計算)。實(shí)際情況中單次藥材用量根本不可能達(dá)到如此大的劑量(通常每次僅取10~20 g泡水或煎服)。因此,分心木在日常使用過程中通常不會出現(xiàn)急性中毒情況。至于兩種分心木是否存在著慢性毒性尚不得而知,有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。但民間應(yīng)用分心木時需要謹(jǐn)慎,如果長期服用,需注意心臟和肝臟功能的異常癥狀。本實(shí)驗(yàn)取得的急性毒性數(shù)據(jù)可為分心木的合理使用提供指導(dǎo),并為后續(xù)開展分心木慢性毒性研究提供參考依據(jù)。

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