RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定壯藥清解霧化液4種成分含量

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530023

壯藥清解霧化液為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在研醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由桑葉、千里光、崗梅根、一點(diǎn)紅等壯藥材組方，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽的功效[1]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，組方藥材中的化學(xué)成分包括生物堿、黃酮類(lèi)和咖啡?？鼘幩犷?lèi)等[2-4]，本文對(duì)其主要有效成分為蘆丁、綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷進(jìn)行研究，建立RP-HPLC同時(shí)測(cè)定4種指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法，為完善壯藥清解霧化液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GH-25電子分析天平(日本A&D公司)； CD-UPT超純水機(jī)(成都越純科技有限公司)；H1650醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 試藥 崗梅根、一點(diǎn)紅、千里光、桑葉藥材(由廣西南寧萬(wàn)寶堂藥業(yè)提供)，經(jīng)廣西中醫(yī)大學(xué)田輝教授鑒定符合2015年版《中國(guó)藥典》一部各品種項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。綠原酸(批號(hào)：110753-201413)、蘆丁(批號(hào)：100080-201409)、金絲桃苷(批號(hào)：111521-201405)、異槲皮苷(批號(hào)：111809-201402)等對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純(成都市科龍化工試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：WondaCractODS-2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈溶液(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(見(jiàn)表1)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：355 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。色譜圖如圖1所示。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序

2.2 供試品溶液 精密移取壯藥清解霧化液25 mL，水浴蒸干，甲醇溶解轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，超聲處理30 min，放冷，精密加入甲醇定容至刻度線，搖勻，10000 /min離心5 min，取上清液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得壯藥清解霧化液供試品。

2.3 陰性對(duì)照溶液 按照壯藥清解霧化液組方工藝配制缺少千里光的陰性樣品，再按“2.2”項(xiàng)下方法制備缺千里光陰性對(duì)照液；同上配制缺少一點(diǎn)紅、千里光、桑葉的陰性樣品，制備缺一點(diǎn)紅、千里光、桑葉陰性對(duì)照樣品。

2.4 混合對(duì)照溶液 精密稱(chēng)取對(duì)照品綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷，加甲醇溶解制成對(duì)照品母液。再精密依次吸取一定體積對(duì)照品母液于同一容量瓶，甲醇定容得濃度依次為0.2220 mg/mL、0.033 mg/mL、0.0208 mg/mL、0.03485 mg/mL的混合對(duì)照品溶液,0.45 μm濾膜濾過(guò)備用。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液10、12、15、18、20、25 μL，分別進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷回歸方程及線性范圍

2.6 精密度考察 取“2.2”項(xiàng)下壯藥清解霧化液供試品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣20 μL，依法測(cè)定記錄綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積，RSD依次為1.4%,1.7%,2.2%,1.2%,表明精密度良好，達(dá)到測(cè)定要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取壯藥清解霧化液供試品溶液，分別于室溫下0, 4, 8, 12, 24, 36 h進(jìn)樣20 μL，依法測(cè)定，記錄綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷峰面積，RSD分別為1.9%，2.4%，2.9%，1.8%，說(shuō)明壯藥清解湯供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，達(dá)到測(cè)定要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2”項(xiàng)下壯藥清解霧化液供試品制備方法，平行制備壯藥清解霧化液供試品溶液6份，按照2.1項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的平均含量分別為0.1948、0.0214、0.0204、0.0280 mg/mL，RSD依次為2.0%,2.5%,2.7%,1.8%，參照2015年版《中國(guó)藥典》四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則準(zhǔn)確度項(xiàng)下樣品待測(cè)定成分含量和回收率限度要求，待測(cè)定成分含量0.01%，重復(fù)性RSD可接受范圍為小于4，良好，達(dá)到測(cè)定要求。

2.9 加樣回收率考察 精密移取已測(cè)定含量的壯藥清解湯6份各10 mL,分別精密加入綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷混合對(duì)照品溶液適量，按照“2.2”項(xiàng)下壯藥清解湯供試品制備方法液,按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定, 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷回收率在96.7%～103.5%,結(jié)果見(jiàn)表3。參照2015年版《中國(guó)藥典》四部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則準(zhǔn)確度項(xiàng)下樣品待測(cè)定成分含量和回收率限度要求，待測(cè)定成分含量0.01%，回收率限度(%)范圍為85～110；結(jié)果表明，符合含量測(cè)定的要求。

表3 綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的加樣回收率 (n=6)

2.8 樣品含量測(cè)定 按既定工藝制3 批壯藥清解湯樣品，每批樣品按“2. 2”項(xiàng)下方法分別制備 3 份壯藥清解湯供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定分析，記錄色譜峰面積，根據(jù)綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各成分含量。結(jié)果見(jiàn)表 4。

表4 壯藥清解湯中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

壯藥清解霧化液處方包括壯藥材桑葉、千里光、崗梅根、一點(diǎn)紅；組方藥材均為功效類(lèi)似狀藥，具有相同的有效成分。經(jīng)文獻(xiàn)查閱，一點(diǎn)紅、桑葉均含有綠原酸、蘆丁、異槲皮苷，千里光含金絲桃苷、綠原酸、蘆丁、槲皮素等[2-4]。本研究通過(guò)保留時(shí)間和千里光專(zhuān)屬成分金絲桃苷為參照的相對(duì)保留時(shí)間共同確定綠原酸、蘆丁、異槲皮苷的色譜峰。

檢測(cè)波長(zhǎng)與流動(dòng)相的確定：參照2015年版《中國(guó)藥典》，千里光含量測(cè)定項(xiàng)金絲桃苷檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)是327 nm；蘆丁與異槲皮苷的苷元都是槲皮素，在358 nm有最大吸收；結(jié)合試驗(yàn)測(cè)定以355 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[5]。以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫；試驗(yàn)中混合對(duì)照品和壯藥清解霧化液中四種成分均達(dá)到基線分離，基線平穩(wěn)，峰型對(duì)稱(chēng)，色譜峰分離度大。本研究對(duì)壯藥清解霧化液3個(gè)批次進(jìn)行含量測(cè)定，4個(gè)成分含量差異較小，說(shuō)明壯藥清解霧化液質(zhì)量穩(wěn)定。

綜上，本研究建立的方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，重復(fù)性強(qiáng)，可為壯藥清解霧化液質(zhì)量控制提供參考。