烏頭堿抑制食管癌EC-1細(xì)胞增殖與侵襲并誘導(dǎo)其凋亡作用研究

周小劍，李玉華，唐湘，呂鈺冰，周嘉彬

烏頭堿抑制食管癌EC-1細(xì)胞增殖與侵襲并誘導(dǎo)其凋亡作用研究

周小劍，李玉華，唐湘，呂鈺冰，周嘉彬

511436 廣州市番禺區(qū)新造醫(yī)院檢驗(yàn)科（周小劍、李玉華、唐湘）；511400 廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科（呂鈺冰、周嘉彬）

研究烏頭堿對(duì)食管癌 EC-1 細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。

CCK8 法及克隆形成抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)烏頭堿對(duì)食管癌 EC-1 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；采用 Hoechst 33258 染色檢測(cè)烏頭堿對(duì) EC-1 細(xì)胞凋亡的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)觀察烏頭堿對(duì)細(xì)胞侵襲能力的作用；Western blot 檢測(cè)藥物作用后細(xì)胞侵襲及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，烏頭堿可明顯抑制食管癌 EC-1 細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間和劑量效應(yīng)（< 0.01），48 h 對(duì) EC-1 細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50）為 6.171 μg/ml。與正常對(duì)照組相比，6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿能明顯降低 EC-1 細(xì)胞克隆形成能力，抑制細(xì)胞侵襲以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且顯著下調(diào) MMP-9 及 Bcl-2 蛋白的表達(dá)。

烏頭堿具有明顯的抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與其抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及促凋亡相關(guān)。

烏頭堿； 食管腫瘤； 細(xì)胞增殖； 腫瘤侵潤(rùn)； 細(xì)胞凋亡

食管癌（esophageal cancer）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，五年內(nèi)生存率在 10% 以下，手術(shù)切除后五年生存率也僅為 15% ~ 40%，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]。由于缺乏特異的臨床表現(xiàn)，超過(guò) 80%的食管癌患者確診時(shí)已為中晚期，失去了手術(shù)治療的機(jī)會(huì)，放化療成為其主要治療方法[2]。然而，放化療常造成機(jī)體損傷，不良反應(yīng)多，嚴(yán)重影響治療效果和患者的生活質(zhì)量[3]。隨著對(duì)傳統(tǒng)中藥研究的不斷深入，中藥治療腫瘤逐漸成為了熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療在提高患者免疫力、增強(qiáng)化療敏感性、減輕不良反應(yīng)以及延長(zhǎng)生存期等方面發(fā)揮著重要作用[4-5]。

烏頭堿（aconitine）（圖 1）是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要有毒成分，也是發(fā)揮藥效的主要有效成分，性味辛、溫，臨床主要用于鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、消炎等，尤適用于消化系統(tǒng)癌痛，產(chǎn)生局部麻醉和鎮(zhèn)痛作用[6]。近年研究顯示，烏頭堿具有明顯的抗腫瘤作用，可抑制癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)凋亡[7-8]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)烏頭堿與食管癌的相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探索烏頭堿對(duì)食管癌EC-1 細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡等影響，為烏頭堿的抗癌機(jī)制研究提供思路。

圖 1 烏頭堿的結(jié)構(gòu)

Figure 1 Structure of aconitine

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細(xì)胞株 人食管癌 EC-1 細(xì)胞由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤防治中心惠贈(zèng)，用含 10%的胎牛血清、1% 鏈霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 U/ml）的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑 烏頭堿購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 112019-201601；DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰酶、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；CCK8試劑盒購(gòu)自日本同仁公司；Transwell 小室及基質(zhì)膠均購(gòu)自廣州藍(lán)吉生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱和 Bio-Tek 酶標(biāo)儀 ELX-800 購(gòu)自美國(guó)Biotech 公司；1300B2 生物安全柜購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；DMI4000 倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó) Leica 公司；750D 照相機(jī)購(gòu)自日本 Canon 公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌 EC-1 細(xì)胞，0.25% 胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至 5 × 104/ml，細(xì)胞懸液移至96 孔板，每孔 200 μl，預(yù)培養(yǎng) 24 h 待細(xì)胞貼壁良好。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（不加入藥物）及藥物處理組（烏頭堿濃度分別為 0.8、1.6、3.2、6.25、12.5、25.0 μg/ml），每組 6 個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng) 24、48、72 h。吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)基 100 μl 和CCK8 反應(yīng)液10 μl，孵育 4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定各組在450 nm 處吸光度值（）。抑制率 =[（陰性對(duì)照組–藥物處理組）/（陰性對(duì)照組–空白對(duì)照組）]× 100%，計(jì)算抑制率及半數(shù)抑制率（IC50）。

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn) 6 孔培養(yǎng)板接種 1200 個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌EC-1 細(xì)胞。37 ℃、5% CO2孵育 24 h 后，加入適當(dāng)濃度的烏頭堿與培養(yǎng)基混合液，待藥物作用 EC-1 細(xì)胞 7 d 后。棄去上清液，1 × PBS 溶液浸洗 2 次，加入 4% 多聚甲醛固定 15 min，棄固定液，加入結(jié)晶紫染液染色 15 min，洗去染液，空氣中干燥，照相。隨后加入 10% 冰醋酸溶液 2 ml，靜置 30 min，待結(jié)晶紫溶解后，取 100 μl 加入 96 孔板中，酶標(biāo)儀讀取各孔 560 nm 波長(zhǎng)處值并計(jì)算克隆抑制率。克隆抑制率（%）=（對(duì)照組–加藥組）/對(duì)照組× 100%。

1.2.3 Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell 小室上室用 100 μl Matrigel 膠包被，在紫外線下照射 2 h。EC-1 細(xì)胞分別進(jìn)行適當(dāng)濃度的烏頭堿處理 48 h 后，0.25% 胰酶消化成細(xì)胞懸液，上室進(jìn)行鋪膠，加入 200 μl 含約 5 × 104個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液，下室加入含 10% 胎牛血清的 DMEM，24 h 后棄去上室培養(yǎng)基，拭去上室內(nèi)的 Matrigel 膠和細(xì)胞，加入 4% 多聚甲醛固定 10 min，1 × PBS 漂洗 2 次，加入 0.1% 結(jié)晶紫染色 10 min，晾干，倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取 3 個(gè)視野于高倍鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.4 Hoechst 33258 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取 1 × 106個(gè)細(xì)胞接種于 6 孔板，制備細(xì)胞爬片，24 h 后用適當(dāng)濃度的烏頭堿分別作用于食管鱗癌 EC-1 細(xì)胞 48 h，進(jìn)行 Hoechst 染色。激發(fā)波長(zhǎng) 350 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng) 460 nm 左右，于倒置熒光顯微鏡高倍鏡下觀察。在不同視野下計(jì)數(shù) 200 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) MMP-9、Bcl-2 蛋白的表達(dá) 將 EC-1 細(xì)胞（1 × 106個(gè)/孔）置于 6 孔板中，待 24 h 細(xì)胞貼壁后加入適當(dāng)濃度烏頭堿孵育 48 h，收集細(xì)胞 PBS 洗滌 2 次，加入細(xì)胞裂解液冰上放置 30 min，1200 r/min、4 ℃離心2 min，取上清，BCA 法蛋白定量。調(diào)整蛋白濃度40 μg/孔進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上，5% 脫脂牛奶封閉后分別加入MMP-9（1:1000）、Bcl-2（1:1000）、β-actin（1:5000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗 3 次后加入相應(yīng) HRP 標(biāo)記二抗（1:3000），37 ℃孵育 1 h，TBST 漂洗 3 次后 ECL 顯色劑顯色并于凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

不同濃度烏頭堿分別干預(yù) EC-1 細(xì)胞 24、48 和 72 h 后，CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制能力。如圖 2 所示，EC-1 細(xì)胞增殖抑制率隨著烏頭堿濃度及作用時(shí)間的增加而增加，呈現(xiàn)明顯的劑量、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，其 IC50分別為10.68、6.171 和4.104 μg/ml。根據(jù)各組抑制率結(jié)果，烏頭堿作用 48、72 h 抑制率相差作用明顯，為保證一定的細(xì)胞存活數(shù)量以及蛋白質(zhì)提取量，故選取作用時(shí)間為 48 h，作用濃度為 6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞抑制率（%）Cell inhibition rate (%)1009080706050403020100 0.8 1.6 3.2 6.25 12.5 25.0 烏頭堿濃度（μg/ml）Concentration of aconitine (μg/ml)

Figure 2 The proliferation inhibition rate of EC-1 cells was detected by CCK8

2.2 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè)

從圖 3A 可見(jiàn)，0、6.25、12.5 μg/ml濃度烏頭堿作用于 EC-1 細(xì)胞 7 d后，各組的克隆形成數(shù)隨藥物濃度增加而減少，藥物濃度越高，克隆能力降低越明顯。溶解結(jié)晶紫后于酶標(biāo)儀讀取各孔 560 nm吸光度（圖3B），各組間吸光度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 127.59，= 0.00）。代入公式計(jì)算得 6.25 和12.5 μg/ml 的烏頭堿對(duì) EC-1 細(xì)胞的克隆抑制率分別為（32.17 ± 1.05）% 和（44.35 ± 0.97）%。

2.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

0、6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿處理 48 h 后，在顯微鏡（× 200）下每孔隨機(jī)選擇 3 個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，三組細(xì)胞的平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為每視野271.5 ± 12.7、165.6 ± 8.2 和 122.4 ± 5.8，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 204.34，= 0.00），提示烏頭堿能抑制 EC-1 細(xì)胞的侵襲能力（圖 4A）。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

Hoechst 33258 染色法觀察 0、6.25、12.5 μg/ml 濃度的烏頭堿處理 EC-1 細(xì)胞 48 h 后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)凋亡細(xì)胞胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色發(fā)白（圖 4B）。鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，對(duì)照組的凋亡指數(shù)為（4.54 ± 0.57）%，6.25、12.5 μg/ml 的烏頭堿作用 EC-1 細(xì)胞后凋亡指數(shù)分別為（29.43 ± 1.57）% 和（64.33 ± 3.89）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 428.56，= 0.00）。

2.5 Western blot 檢測(cè) MMP-9、Bcl-2 蛋白表達(dá)

不同濃度烏頭堿作用 EC-1 細(xì)胞 48 h 后，Western blot 檢測(cè)得侵襲相關(guān)蛋白 MMP-9 蛋白的表達(dá)下調(diào)（0.51 ± 0.02、0.34 ± 0.01、0.18 ± 0.01），凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2 蛋白的表達(dá)量也減少（0.86 ± 0.04、0.67 ± 0.02、0.23 ± 0.02），且呈劑量依賴性（< 0.01）（圖 4C）。

3 討論

中藥在增強(qiáng)機(jī)體免疫力和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面具有獨(dú)特的療效，多種中藥成分能有效發(fā)揮抗腫瘤作用[9-10]，且其副作用低，逐漸引起眾多研究者的關(guān)注。現(xiàn)代藥理研究表明，烏頭類中藥如烏頭、附子等具有回陽(yáng)救逆、祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效，主要用于治療跌打損傷、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎、中風(fēng)癱瘓、神經(jīng)性疼痛、胃腸炎、癰疽瘡毒等癥[11-12]。烏頭堿作為多效性天然活性物質(zhì)，在強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等方面已顯示了良好的療效[6]。以往，對(duì)烏頭堿的研究主要集中于對(duì)心肌細(xì)胞及心血管系統(tǒng)方面，與腫瘤相關(guān)研究報(bào)道較少。隨著對(duì)烏頭堿的研究不斷深入，研究者逐漸發(fā)現(xiàn)烏頭堿的抗癌價(jià)值。

0 6.25 12.5烏頭堿（μg/ml）Aconitine (μg/ml) A5602.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 0 6.25 12.5 A 烏頭堿濃度（μg/ml）Concentration of aconitine(μg/ml)B

Figure 3 Inhibition of different concentrations of aconitine on the ability of EC-1 cells to clone and form esophageal cancer (A: Platelet assay was used to detect cell clonal ability; B: Quantitative detection of cell clonal ability by spectrophotometry;*Compared with the control group,< 0.01)

0 6.25 12.5 烏頭堿（μg/ml）Aconitine (μg/ml)A

Figure 4 Effects of aconitine on the invasion and apoptosis of EC-1 cells in esophageal cancer [A: Transwell assay was used to detect changes in the invasion ability of aconitine on EC-1 cells (× 200); B: Apoptosis of EC-1 cells after treatment with aconitine was detected by Hoechst 33258 (× 200 ); C: Western blot was used to detect the effects of aconitine on MMP-9 and Bcl-2 proteins in EC-1 cells]

研究顯示，烏頭堿能抑制大分子 DNA、RNA 的合成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。Ji 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度烏頭堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率呈時(shí)間和劑量依賴性，并可通過(guò)NF-κB 信號(hào)通路誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞的凋亡。烏頭堿也可通過(guò)抑制 PI3K/AKT 和 MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路影響 PCNA mRNA 及其蛋白的表達(dá)，從而在體內(nèi)、外抑制黑色素瘤的增殖及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[8]。Pyaskovskaya 等[14]報(bào)道，烏頭堿成分能增強(qiáng)二氯乙酸對(duì) Ehrlich 癌細(xì)胞的殺傷作用。

本研究以食管癌為研究對(duì)象，利用 CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)不同濃度的烏頭堿對(duì)食管癌 EC-1 細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，并呈時(shí)間-濃度依賴關(guān)系；EC-1 細(xì)胞的克隆形成能力也隨烏頭堿的濃度增加而遞減，證實(shí)了烏頭堿能有效抑制 EC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是晚期食管癌的重要死因，因此降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力尤為關(guān)鍵。烏頭堿能顯著抑制 EC-1 細(xì)胞的侵襲，并隨烏頭堿濃度的增加，抑制能力越強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，在侵襲過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)降解或是長(zhǎng)出基膜是造成腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的主要原因，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是基質(zhì)降解過(guò)程中最為關(guān)鍵的蛋白水解酶。對(duì) MMPs 的研究始于 1962 年，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 28 種人源性MMPs，它們屬于依賴鋅的內(nèi)生肽酶家族，其中包括 MMP-9[15]。當(dāng)前，臨床研究中發(fā)現(xiàn)，在胃癌、肺癌、乳腺癌等疾病中，MMP-9 的表達(dá)水平最高，這主要是和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)系[16]。本研究中，6.25、12.5 μg/ml 烏頭堿與對(duì)照組相比能明顯抑制 MMP-9 的表達(dá)，提示烏頭堿通過(guò)下調(diào) EC-1 細(xì)胞侵襲能力從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序性死亡，又稱 I 型程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制之一。本研究運(yùn)用 Hoechst 33258 染色法證實(shí)了烏頭堿對(duì) EC-1 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，且有濃度依賴性，提示了烏頭堿抑制 EC-1 細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，其機(jī)制可能與降低了凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2 的影響有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)烏頭堿能抑制食管癌 EC-1 細(xì)胞增殖，克隆形成能力、侵襲能力亦呈劑量依賴性降低，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。我們將進(jìn)一步探討烏頭堿的抗癌機(jī)制，為食管癌的臨床治療提供新的思路和依據(jù)。

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Aconitine inhibits the proliferation and invasion while induces the apoptosis of esophageal cancer EC-1 cells

ZHOU Xiao-jian, LI Yu-hua, TANG Xiang, LYU Yu-bing, ZHOU Jia-bin

Department of Clinical Laboratory, Xinzao Hospital, Guangzhou 511436, China (ZHOU Xiao-jian, LI Yu-hua, TANG Xiang); Department of Clinical Laboratory, Panyu Center Hospital, Guangzhou 511400, China (LYU Yu-bing, ZHOU Jia-bin)

To investigate the effects of aconitine on the proliferation, invasion and apoptosis of esophageal cancer cells EC-1.

CCK8 assay and colony formation experiment were used to check the inhibitory effect of aconitine on EC-1 esophageal cancer cell growth. Effect of aconitine on apoptosis in EC-1 cells was detected by Hoechst 33258 staining assay. Transwell method was used to valuate the ability of cell invasion after aconitine treatment. Western blot was used to detect the expression of proteins related to cell invasion and apoptosis after treatment.

Aconitine significantly inhibited the proliferation of esophageal cancer cell line EC-1 in both time- and dose-dependent manner (< 0.01). The half inhibitory concentration of 48 h on EC-1 cells was 6.171 μg/ml. When compared with the normal control group, 6.25 and 12.5 μg/ml aconitine treatment could significantly reduce the colony formation and cell invasion, while induce apoptosis in the cells, and aconitine also significantly reduce the expression of MMP-9 and Bcl-2.

Aconitine has significant antitumor effect, which may be correlated with the inhibition of tumor cell proliferation and invasion as well as the induction of apoptosis.

Aconitine; Esophageal neoplasms; Cell proliferation; Neoplasm invasiveness; Apoptosis

ZHOU Xiao-jian, Email: lwtgzq@yeah.net

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.008

周小劍，Email：lwtgzq@yeah.net

2019-03-29