核桃葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生研究

戴小云 武春霞

摘? 要：以雜種核桃組培苗的葉片和葉柄為材料，設(shè)置5種激素組合進(jìn)行葉片和葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)，并設(shè)置4種激素組合進(jìn)行愈傷組織再分化的誘導(dǎo)，以研究雜種核桃的組培再生技術(shù)。結(jié)果表明：葉柄較葉片更容易發(fā)生愈傷組織，并且褐化率較低;TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1 2種植物激素組合最適合愈傷組織的誘導(dǎo)。產(chǎn)生的愈傷組織呈白色和黃白色，為非胚性愈傷組織。在4種激素組合下愈傷組織器官，但均未誘導(dǎo)成功。部分愈傷組織有增殖，培養(yǎng)1個(gè)月后全部褐化。研究說明雜種核桃的愈傷組織較容易誘導(dǎo)發(fā)生，而器官的再分化較困難。

關(guān)鍵詞：核桃;愈傷組織;植物激素;植株再生

中圖分類號(hào) S662文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）13-0044-04

Abstract：In order to study the tissue culture regeneration technology of hybrid walnut，in this study we used the leaves and petioles of hybrid walnut tissue culture seedlings as materials，and 5 hormone combinations were set to induce callus of leaves and petioles. In addition，4 hormone combinations were set to induce callus redifferentiation. The results showed that the petioles was more easy to induce callus than leaves，and the browning rate was lower. We found two hormone combinations which TDZ4mg·L-1+2，4-D1.5mg·L-1 and 6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+TDZ1.0mg·L-1 were the most suitable for callus induction. The callus induced was white and yellowish white，but it was non-embryonic callus. Organ induction from callus was all not successful under the combinations of 4 hormones. Some of the callus proliferated and all browned after cultured one month. It showed that callus of hybrid walnut was easy to induce，but the redifferentiation of organs was difficult. The results of this study laid a certain foundation for further study on walnut callus organ differentiation.

Key words：Walnut;Callus;Phytohormone;Plant Regeneration

1 前言

核桃（Juglan regia L.）屬胡桃科核桃屬的落葉高大喬木，因其核仁營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特和用途多樣而躋身于世界四大干果之一。核桃具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，除核仁可食用外，其全株各個(gè)部分都各有用途[1-3]，因而成為農(nóng)民脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)樹種，也是我國糧油的戰(zhàn)略儲(chǔ)備樹種，具有良好的發(fā)展前景。

植物組織培養(yǎng)是重要的生物技術(shù)之一，在植物的快速繁殖、資源的離體保護(hù)等方面已廣泛應(yīng)用。植物組織培養(yǎng)在植物生物技術(shù)中占據(jù)著核心位置，通過植物組織培養(yǎng)還可以實(shí)現(xiàn)植株的再生。目前已在多種植物上獲得成功，如柚木、棗樹、藍(lán)莓等[4-6]，為植物基因工程遺傳轉(zhuǎn)化及優(yōu)良無性系的快速繁殖研究奠定了基礎(chǔ)。自上世紀(jì)60年代末，世界各地開始了核桃組織培養(yǎng)技術(shù)的研究。1969年，美國的Cummins等首次誘導(dǎo)黑核桃（Juglans nigra）莖段獲得了愈傷組織，然而并未得到分化的器官。1981年，Chalupa以改良的MS為基本培養(yǎng)基，首次報(bào)道了以核桃實(shí)生苗莖段作為外植體的完整植株形成過程[7]。我國關(guān)于核桃組織培養(yǎng)的相關(guān)研究開始較晚，直到1986年，袁巧平等以核桃腋芽作為外植體，重點(diǎn)研究了植物激素條件對(duì)誘導(dǎo)核桃形成完整植株的影響[8]。湯浩茹等在2000年采用核桃的幼胚胚軸和子葉作為外植體，成功的誘導(dǎo)出了體細(xì)胞胚和完整的植株[9]。然而，該技術(shù)難度較大，取材時(shí)期要求較嚴(yán)格、污染較高、外植體易褐化，并且較難分化、容易發(fā)生退化現(xiàn)象、增殖速率不高、生根困難，這一系列的問題一直都沒能得到很好的解決。核桃組培苗無菌，葉片數(shù)量較大，容易獲得，因此是良好的外植體材料。關(guān)于葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，目前已有報(bào)道，李好先、張燕等分別以綠波核桃和汾陽核桃葉片為試材，進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)[10，11]。然而，關(guān)于核桃葉片誘導(dǎo)植株再生的研究，目前還比較少，并且比較困難。

在植物組織培養(yǎng)中，植物激素是重要的調(diào)節(jié)劑。生長素和細(xì)胞分裂素尤為重要，在愈傷組織的誘導(dǎo)和器官的分化中起著重要的調(diào)節(jié)作用。不同激素種類及濃度的組合所產(chǎn)生的作用效果截然不同。一般當(dāng)生長素濃度相對(duì)細(xì)胞分裂素濃度高時(shí)有利于組培苗根的分化，反之則利于不定芽的形成。Heile-Sudholt等在以黑核桃的胚軸和實(shí)生苗莖尖為外植體的誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)胚根、上胚軸、不定芽及愈傷組織誘導(dǎo)在很大程度上受到6-BA濃度的影響，且6-BA能刺激愈傷組織的形成[12]。TDZ是活性較高的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，李好先等采用綠波核桃葉片作為外植體，研究結(jié)果表明較低濃度的TDZ（2.0～4.0mg·L-1）對(duì)葉片愈傷組織的形成具有促進(jìn)作用;高濃度（8.0～10.0mg·L-1）則作用相反，同時(shí)對(duì)葉片和愈傷組織的褐化有抑制作用，使形成的愈傷組織比較疏松。生長素在愈傷組織的形成中也具有重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)低濃度的IBA（0.01～0.5mg·L-1）對(duì)葉片愈傷組織的形成是有利的，高濃度的IBA（>1.0mg·L-1）則抑制愈傷組織的形成[13]。由此可見，同種植物激素的不同類型在組織培養(yǎng)中的作用和對(duì)于不同的材料植物激素所起的作用都存在一定的差異。

本研究以雜種核桃為試材，該種核桃生長旺盛，可以作為良好的砧木，研究其無性化繁殖對(duì)核桃的良種化和一致性具有重要的意義。因此，我們以該種核桃葉片為外植體，利用不同組合的生長素和細(xì)胞分裂素，篩選適宜核桃愈傷組織誘導(dǎo)及器官分化的最佳組合，為核桃的遺傳轉(zhuǎn)化研究及無性系的快速繁殖奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)以天津農(nóng)學(xué)院東校區(qū)雜種核桃樹為試驗(yàn)材料。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 無菌體系的建立 選擇在晴天采集健康無損傷的核桃嫩枝帶回實(shí)驗(yàn)室。去掉葉柄，留下1段小葉柄。用軟刷蘸取洗潔精刷洗嫩枝，并置于流水沖洗2～3h。之后用0.3%的過氧乙酸進(jìn)行消毒處理，處理2次，每次5min，然后用無菌水漂洗3～4次。分割成1芽1段接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2.2 葉片和葉柄愈傷組織的誘導(dǎo) 取無菌苗中上部葉片為試材，將葉片切分成1cm×1cm的小塊，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置5種激素配比，分別為6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理1），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理2），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1（處理3），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（處理4），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（處理5）。

2.2.3 愈傷組織器官分化誘導(dǎo) 將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織切分成1cm×1cm的小塊，接種于器官分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置4種激素配比6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理6），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理7），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（處理8），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（處理9）。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同激素組合對(duì)葉片愈傷組織形成的影響 從表1中可以看出，處理1和處理3愈傷組織發(fā)生量最多，并且處理3的葉片褐化數(shù)最少;處理5的效果最差，愈傷組織發(fā)生量最少，只有3個(gè)愈傷組織形成且較小。由于接種后置于黑暗條件培養(yǎng)，產(chǎn)生的愈傷組織主要呈黃白色或白色。

從圖1中可以看出，愈傷組織發(fā)生率由高到低依次為處理1>處理3>處理4>處理2>處理5，處理1、處理3和處理4之間差異不明顯，處理5與其他處理之間有明顯的差異，并且其褐化也較明顯。綜合比較處理3最適合核桃葉片愈傷組織的誘導(dǎo)。

3.2 不同部位對(duì)愈傷組織發(fā)生的影響 本試驗(yàn)分別以葉片和葉柄為材料進(jìn)行了愈傷組織的誘導(dǎo)。從表2中可以看出，整體上各個(gè)處理下葉柄愈傷組織的發(fā)生量大于葉片愈傷組織的發(fā)生量，尤其在處理3和處理4誘導(dǎo)下葉柄的愈傷組織發(fā)生量最大，并且在處理4下葉柄愈傷組織的發(fā)生率達(dá)到100%。

由圖2可見，葉柄總的愈傷組織發(fā)生率明顯高于葉片愈傷組織的發(fā)生，愈傷組織平均出愈率為67%;而褐化率剛好相反，葉柄的褐化率明顯低于葉片的褐化率，葉柄平均褐化率為17%。說明葉柄比葉片更容易產(chǎn)生愈傷組織，并且不易發(fā)生褐化。

3.3 不同激素組合對(duì)愈傷組織器官分化的影響 本試驗(yàn)分別以葉片和葉柄產(chǎn)生的愈傷組織，在4種激素組合下進(jìn)行了再分化的誘導(dǎo)。于誘導(dǎo)后的15d和30d分別進(jìn)行觀察。從表3中可以看出，誘導(dǎo)后的15d處理6和處理8仍有部分未褐化，處理7和處理9已全部褐化。處理8愈傷組織有明顯的增殖，顏色轉(zhuǎn)為綠色。其他處理的愈傷組織也有不同程度的變綠現(xiàn)象，處理6中愈傷組織表面出現(xiàn)白色粉狀物，沒有發(fā)現(xiàn)器官的分化。到誘導(dǎo)的30d時(shí)，所有處理的愈傷組織全部發(fā)生褐化，并且褐化明顯加重。處理6和處理8的愈傷組織有明顯的增殖，褐色部分增多，在愈傷組織的中部仍呈綠色。處理9的褐化程度最重，顏色呈黑褐色，仍未見器官的分化。

從表4可以看出，在誘導(dǎo)后的15d，處理7、處理8和處理9都有部分未褐化，尤其處理8和處理9未褐化數(shù)量較多，處理8愈傷組織呈綠白色，處理9愈傷組織呈黃白色至淺綠色。處理7愈傷組織大部分褐化，并且愈傷組織上部出現(xiàn)水浸狀。各處理均為出現(xiàn)器官的分化。誘導(dǎo)后30d時(shí)，只有處理8為全部發(fā)生褐化，愈傷組織中部呈綠色，較松散。處理6的愈傷組織沒有明顯增殖，全部褐化呈黑色。處理9的愈傷組織仍有大部分呈綠色，但上部發(fā)生褐化較嚴(yán)重。所有的處理都沒有產(chǎn)生器官的分化。

4 結(jié)論

以葉片和葉柄作為材料誘導(dǎo)愈傷組織，葉柄比葉片更容易產(chǎn)生愈傷組織。綜合愈傷組織發(fā)生率及褐化率，在植物激素TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1的條件下，最利于葉片愈傷組織的形成。在植物激素TDZ 4mg·L-1+2，4-D 1.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1的條件下，最利于葉柄愈傷組織的形成。在這5種激素組合誘導(dǎo)下形成的愈傷組織都是非胚性愈傷組織。在6-BA 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理6），TDZ 4mg·L-1+2，4-D 0.5mg·L-1（處理7），6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+TDZ 1.0mg·L-1（處理8），KT 0.8mg·L-1+NAA 0.4mg·L-1（處理9）4種激素處理下，葉片及葉柄產(chǎn)生的愈傷組織均未發(fā)生器官的分化。

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（責(zé)編：楊 林）