Bouin氏液二次固定時(shí)間對家兔肝臟纖維化Masson三色染色的影響

徐艷　王玲　董洋　郭冬梅　李延輝

【摘要】 目的：探討B(tài)ouin氏液二次固定時(shí)間對Masson三色染色效果的影響，進(jìn)一步尋找Bouin氏液二次固定的最佳條件。方法：取5例肝纖維化模型家兔肝臟組織（10%中性福爾馬林固定）的蠟塊，切片、脫蠟后，用Bouin氏液二次固定，固定時(shí)間分別為0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、過夜。進(jìn)行Masson三色染色并用光鏡和統(tǒng)計(jì)軟件分析比較染色結(jié)果。結(jié)果：未經(jīng)二次固定的切片與所有經(jīng)過二次固定的切片染色評分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;二次固定過夜的染色效果最好，其與二次固定4 h染色評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05）。結(jié)論：Bouin氏液二次固定的肝纖維化切片的Masson三色染色效果優(yōu)于僅經(jīng)福爾馬林固定的切片;二次固定4 h或過夜切片的染色效果最佳。

【關(guān)鍵詞】 Bouin氏液; 10%中性福爾馬林; Masson三色染色; 肝纖維化

【Abstract】 Objective：To evaluate the results of Massons tri-colour staining at different times of re-fixation the paraffin fixation sections in Bouins solution，searching for the best condition for re-fixation in Bouins solution.Method：The wax block of 5 liver fibrosis model rabbit liver tissue（10% neutral Formalin fixation）was taken.Bouins solution was used to re-fixation the paraffin fixed sections after slicing and dewaxing.The re-fixation time were 0 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，all night long.Proceeding Massons tri-color staining.The staining results with light microscopy and statistical software were compared.Result：There were statistically significant differences in taining scores between re-fixation sections and the Paraffin fixed sections（P<0.05）.Among all the groups，the group whose re-fixation time of all night long had the best staining effect，and it had no statistically significant difference with the group whose re-fixation time of 4 h（P>0.05）.Conclusion：Massons tri-colour staining of liver fibrosis sections fixed with Bouins solution twice was better than that of fixation with Formalin only.

【Key words】 Bouins solution; 10% moderate Formalin; Massons tri-colour staining; Liver fibrosis

First-authors address：Dalian Jinzhou First Peoples Hospital，Dalian 116100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.12.006

Masson三色染色（以下簡稱Masson染色）是一種經(jīng)典的特殊染色方法，可以顯示細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外膠原三種組織結(jié)構(gòu)[1]，尤其易于觀察膠原纖維的空間結(jié)構(gòu)[2]，可以彌補(bǔ)在HE染色中被染成淡粉色而與肌纖維等成分難以區(qū)分的不足，但因該染色操作繁瑣、對組織固定要求高等問題一直未能在常規(guī)病理診斷中得到普及應(yīng)用。研究顯示Bouin氏液固定組織Masson染色效果優(yōu)于病理科最常用的組織固定劑——10%中性福爾馬林[3-6]。有研究報(bào)道，經(jīng)甲醛固定的組織如果要獲得滿意的Masson染色效果，必須再經(jīng)過第二次固定[7]。本實(shí)驗(yàn)試探討福爾馬林固定的石蠟組織使用Bouin氏液二次固定的時(shí)間對Masson染色效果的影響，進(jìn)一步尋找Bouin氏液二次固定的最佳條件?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化模型家兔肝組織蠟塊，由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院郭冬梅課題組提供。所有標(biāo)本在離體后均經(jīng)10%中性福爾馬林固定;所有蠟塊切片均已進(jìn)行Batts-Ludwig肝纖維化分期[6]，從0～4期（F0～F4期）肝纖維化組織蠟塊中各隨機(jī)挑選1例（共計(jì)5例）納入本實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 Bouin氏液（1.22%苦味酸飽和液、甲醛、冰醋酸按15︰5︰1的比例混合），購自北京華越洋生物科技有限公司;Masson染色試劑套裝，包括Weigert鐵蘇木素A液（主要含蘇木素）、Weigert鐵蘇木素B液（主要含三氯化鐵水溶液）、麗春紅酸性品紅染液、磷鉬酸溶液、苯胺藍(lán)染液，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;甲醛溶液、無水酒精、二甲苯，均為分析純，均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;冰醋酸，分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司。所需儀器主要有Thermo HM340E切片機(jī)、亞光生物組織攤拷片機(jī)、恒宇電熱恒溫箱、OLYMPUS BX43光學(xué)顯微鏡。

1.3 切片與分組 本實(shí)驗(yàn)依二次固定時(shí)間的不同分為A、B、C、D、E、F、G組，分別進(jìn)行染色，其中A組不進(jìn)行二次固定，B～G組均采用Bouin氏液進(jìn)行二次固定，固定溫度37 ℃，固定時(shí)間：B組15 min、C組30 min、D組1 h、E組2 h、F組4 h、G組過夜。每例蠟塊連續(xù)切7張3.5 μm厚白片且均按照A～F順序編號（共計(jì)35張），60 ℃烤片1 h備用。

1.4 方法與步驟 （1）脫蠟：二甲苯60 ℃ 0.5 h兩次，無水酒精10 min兩次，95%酒精10 min兩次，75%酒精10 min兩次后至水;（2）二次固定（具體見“分組”，A組跳過此步），流水沖洗至黃色褪盡（約10 min）;（3）媒染：Weigert鐵蘇木素A、B混合液滴染10 min，自來水稍洗;（4）分化返藍(lán)：1%鹽酸酒精數(shù)秒，自來水沖洗10 min，蒸餾水稍洗;（5）麗春紅酸性品紅溶液滴染10 min，蒸餾水洗稍洗;（6）磷鉬酸溶液滴染3 min，傾去;（7）苯胺藍(lán)溶液滴染3 min，傾去;（8）1%冰醋酸溶液涮洗至無藍(lán)色脫出;（9）脫水、透明：95%酒精稍洗兩次，無水酒精10 min兩次，二甲苯10 min兩次;（10）中性樹膠封固。本實(shí)驗(yàn)共分7次完成（每次進(jìn)行一組），每組實(shí)驗(yàn)除二次固定時(shí)間不同外，其余實(shí)驗(yàn)條件及步驟均嚴(yán)格統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行。

1.5 染色評分 光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)低倍視野，分別對A～G組35張切片的Masson染色情況進(jìn)行評估。本實(shí)驗(yàn)Masson染色質(zhì)量評估參考李金龍等[8]的方法從膠原纖維、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)分明程度以及細(xì)胞核分辨率四個(gè)方面分別進(jìn)行評估，具體評估標(biāo)準(zhǔn)：膠原纖維（不著色0分、著色不均勻或有暈1分、著色均勻且中等強(qiáng)度2分、著色均勻且高強(qiáng)度3分）、細(xì)胞質(zhì)（不著色0分、著色不均勻1分、著色均勻且中等強(qiáng)度2分、著色均勻且高強(qiáng)度3分）、核質(zhì)分明（無0分、弱1分、中等2分、強(qiáng)3分）、核分辨率（無0分、低1分、中等2分、高3分）。參照Metgud等[9]的方法，本次評分總得分范圍為0～12分（0～4分表示染色效果不滿意、5～7分表示染色可以滿足診斷但效果一般、8～12分表示染色可以滿足診斷且效果較好）。采用單盲評分，由本科一名資深的主任醫(yī)師完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。并用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行作圖分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肉眼觀察G、F、E、D、C、B、A組中的肝組織切片，顏色由紫紅色到紫黑色逐漸加深。光鏡下，G組切片中膠原纖維染成藍(lán)色，肝細(xì)胞漿、平滑肌肌纖維等胞質(zhì)以及紅細(xì)胞染成不同程度的紅色，胞核染成黑褐色，核質(zhì)分明，顏色鮮麗，對比度清晰，F(xiàn)組的情況與之相仿;E、D、C、B、A組切片光鏡下依次顯示背景染色逐漸加深;A組中肝細(xì)胞漿呈深紫紅色，與肝細(xì)胞核辨別困難，在其背景上的膠原纖維不易識別;0期纖維化肝組織的膠原纖維在各組中著色普遍較淡，A～E組內(nèi)新形成的細(xì)絲狀膠原纖維邊緣均可見暈染;F和G組相對染色效果較好，膠原纖維、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及核漿對比度均顯色較清晰。

本實(shí)驗(yàn)各組5例不同程度的纖維化肝組織Masson染色評分顯示，D、E、G、F四組的染色評分均值都在7分以上，可以滿足診斷需要;而A、B、C三組的染色評分中均有低于5分者，屬染色效果不滿意。經(jīng)方差分析結(jié)果顯示，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=31.476，P=0.000）;進(jìn)一步各組兩兩比較顯示，A組與其余B～G組的染色評分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）;G組分別與B、C、D、E組評分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.000、0.005）;F組分別與B、C、D組評分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000、0.000、0.017）;E組分別與B、C組評分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）;D組分別與B、C組評分比較差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004、0.012）;B組與C組、D組與E組、E組與F組、F組與G組的評分比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.688、0.181、0.284、0.083）。見表1。提示二次固定實(shí)驗(yàn)組中，G組的染色效果最好，其與F組的染色效果相當(dāng);E組和D組的染色效果居中，且兩者的染色效果相當(dāng);B組和C組的染色效果最弱，且兩者染色效果相當(dāng)。進(jìn)一步采用GraphPad Prism 5.0對各組中不同程度纖維化肝組織染色評分的均值進(jìn)行分析，得出不同程度纖維化肝組織在不同二次固定時(shí)間下Masson染色評分均值分布情況。0～4期的肝纖維化組織在D、E、F、G組的染色效果明顯優(yōu)于A、B、C組，其中G組的染色效果最好，F(xiàn)組與其評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

3 討論

3.1 Bouin氏液在Masson染色中的優(yōu)勢 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，纖維化肝組織Masson染色效果與二次固定的條件及時(shí)間差異有關(guān)（P=0.000），所有經(jīng)Bouin氏液二次固定后的纖維化肝組織Masson染色效果均明顯優(yōu)于僅經(jīng)甲醛固定后的組織（P=0.000），此結(jié)果與陳余朋等[10]的研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)所用的Masson染色法是聯(lián)合使用媒染劑（鐵、鉬）和分子量大小不同的染料（苯胺藍(lán)、麗春紅、酸性品紅等）選擇性的作用于膠原纖維、肌纖維、細(xì)胞質(zhì)、紅細(xì)胞以及細(xì)胞核，使其顯示不同程度的藍(lán)、紅、黑褐等三種色系。趙熒等[11]認(rèn)為固定后的組織因其蛋白質(zhì)暴露于固定劑，結(jié)構(gòu)鏈與之發(fā)生作用形成蛋白質(zhì)“網(wǎng)絡(luò)”，這些“網(wǎng)絡(luò)”因其孔隙大小和數(shù)量的不同而具有不同特征;染色時(shí)分子量不同的染料對組織結(jié)構(gòu)的選擇性作用以及組織內(nèi)部因固定所形成的結(jié)構(gòu)（即“網(wǎng)絡(luò)”）變化便決定了Masson染色的成敗;小的染料分子可浸透至?。ㄈ缂t細(xì)胞）、中（如肌纖維、細(xì)胞質(zhì)）、大（如膠原纖維）三種“網(wǎng)絡(luò)”內(nèi);中等大的染料分子可置換出位于中、大“網(wǎng)絡(luò)”內(nèi)的小染料分子而著色;大分子染料則可置換出位于大“網(wǎng)絡(luò)”中的中、小染料分子進(jìn)行著色。因此，使用有利于形成大、中、小“網(wǎng)絡(luò)”的組織固定劑是做好Masson染色的關(guān)鍵。Bouin氏液是一種包括苦味酸、甲醛和冰醋酸的混合固定液，其中冰醋酸能使組織膠原纖維膨脹[12]，其與苦味酸配伍能抑制苦味酸對膠原纖維的收縮[13]，這種固定液穿透力均勻且迅速、組織收縮不明顯[14-15];而福爾馬林固定液成分則相對單一，無法像Bouin氏液一樣做到對組織內(nèi)在結(jié)構(gòu)膨脹與收縮不同層次的細(xì)微調(diào)整。

3.2 最佳的二次固定時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)中，光鏡下纖維化肝組織Masson染色效果的好壞主要表現(xiàn)在新形成的細(xì)絲狀膠原纖維邊緣的暈染以及膠原纖維與背景組織著色的對比度上。研究表明，固定時(shí)間不足、完全滲入細(xì)胞內(nèi)的固定液不足，導(dǎo)致細(xì)胞成分固定不均勻[16]，影響染色效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在所有二次固定的纖維化肝組織中，過夜的染色效果最好，4 h次之，2、1 h居中，30、15min最差;其中，二次固定過夜與4 h的染色效果均能達(dá)到較好的程度，日常工作中在保證染色質(zhì)量不影響診斷的條件下，F(xiàn)組相比G組制片所需時(shí)間更短，效率更高，更符合工作要求。

3.3 Masson染色的其他影響因素 依本次實(shí)驗(yàn)所得經(jīng)驗(yàn)，除固定液外，Masson染色過程中還需注意以下問題：（1）切片脫蠟徹底。保持脫蠟劑的濃度，做到及時(shí)更換，可避免因脫蠟不足造成的組織與染料無法充分結(jié)合而有模糊不清的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用60 ℃二甲苯脫蠟，可快速徹底地將石蠟脫干凈。（2）褪黃徹底：切片在經(jīng)Bouin氏液固定后，務(wù)必將固定液洗凈后再進(jìn)行后續(xù)染色。（3）Weigert鐵蘇木素A、B液即用即配：因?yàn)殍F與染色劑的色素根化合后會(huì)形成不溶性沉淀而不能在配置后長期放置。（4）光鏡下調(diào)整磷鉬酸的分化程度：當(dāng)紅染的膠原纖維變淡，區(qū)別于肌纖維時(shí)即可終止分化——此步驟很關(guān)鍵[17]，因?yàn)榱足f酸既是分化劑也是膠原纖維的特異性媒染劑，在分化時(shí)它選擇性作用于膠原纖維，使其釋放已結(jié)合的中分子染料（呈淡紅色），而后與大分子染色劑苯胺藍(lán)相結(jié)合形成復(fù)合物，牢固地附著于膠原纖維上（顯藍(lán)色）。（5）冰醋酸溶液與95%酒精均有一定的脫色性，浸洗時(shí)不可時(shí)間過長，否則會(huì)引起褪色而影響染色效果[18]。

本實(shí)驗(yàn)中，二次固定1、2 h的纖維化肝組織的染色效果雖然也可以滿足診斷需要，但是與4 h和過夜的染色效果相比還有一定差距。筆者認(rèn)為倘若適當(dāng)提高二次固定的溫度，固定液滲透速度加快，或許會(huì)改善這兩組的染色效果，這一假設(shè)尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，Bouin氏液二次固定的肝組織切片進(jìn)行Masson染色確定可以達(dá)到滿意效果，以過夜和4 h的染色效果為最佳。滿意的Masson染色既能顯示波浪狀分布的成熟纖維束，也能清晰顯示較難識別細(xì)絲狀的新生膠原纖維，現(xiàn)多用于評估肝穿、腎穿組織炎癥時(shí)的修復(fù)情況和纖維化程度[19-20]，極具應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)濟(jì)又有效的Bouin氏液二次固定無疑能為只有甲醛固定標(biāo)本的基層醫(yī)院病理科開展Masson染色解決標(biāo)本固定的難題，值得臨床推廣。

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（收稿日期：2018-11-07） （本文編輯：程旭然）