不同證型代謝綜合征與CDKAL1、PPARG基因的關(guān)系分析

康潔　丁珊珊　張凌媛　沈建英

【摘要】 目的：探討代謝綜合征（MS）中痰濕壅盛、氣陰兩虛證型與CDKAL1、PPARG基因的關(guān)系。方法：選取60例MS患者，按照證型將其分為痰濕壅盛組、氣陰兩虛組，各30例，同時選取健康人群30例為對照組;采用實(shí)時熒光定量PCR（Q PCR）技術(shù)檢測CDKAL1、PPARG基因，分析CDKAL1、PPARG基因與兩種證型的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果：痰濕壅盛、氣陰兩虛組CDKAL1、PPARG基因表達(dá)均高于對照組（P<0.000 1），且氣陰兩虛組CDKAL1基因表達(dá)高于痰濕壅盛組（P<0.05）;氣陰兩虛組PPARG基因表達(dá)高于痰濕瘀滯組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：MS患者CDKAL1、PPARG基因表達(dá)均上調(diào)，與不同證型-痰濕壅盛與氣陰兩虛表達(dá)均呈一定的相關(guān)關(guān)系。

【關(guān)鍵詞】 代謝綜合征; 證型; 細(xì)胞周期素依賴性激酶5調(diào)節(jié)亞單位相關(guān)蛋白1類似物1; 過氧化物酶體增生激活受體γ

【Abstract】 Objective：To explore the relationship between the syndrome of accumulation of phlegm dampness and deficiency of both vital energy and yin in metabolic syndrome（MS）and CDKAL1 and PPARG genes.Method：60 MS patients were selected，according to syndrome types，they were divided into accumulation of phlegm dampness group and deficiency of both vital energy and yin group，30 cases in each group，at the same time，30 healthy people were selected as control group.CDKAL1 and PPARG genes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR（Q PCR），and the correlation between CDKAL1 and PPARG genes and the two syndromes was analyzed.Result：The expression of CDKAL1 and PPARG gene in accumulation of phlegm dampness group and deficiency of both vital energy and yin group were higher than those of control group（P<0.000 1），and the expression of CDKAL1 gene in deficiency of both vital energy and yin group was higher than that of accumulation of phlegm dampness group（P<0.05），the expression of PPARG gene in deficiency of both vital energy and yin group was higher than that of accumulation of phlegm dampness group，but the difference was not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：The expression of CDKAL1 and PPARG genes were up-regulated in MS patients，which were correlated with different syndromes-accumulation of phlegm dampness and deficiency of both vital energy and yin.

【Key words】 Metabolic syndrome; Syndrome type; CDKLA1; PPARG

First-authors address：Fujian University of TCM，F(xiàn)uzhou 350122，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.12.002

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是指受遺傳與環(huán)境因素影響，人體的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等物質(zhì)發(fā)生代謝紊亂的病理狀態(tài)，是一組復(fù)雜的代謝紊亂癥候群，是導(dǎo)致糖尿病、心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。MS不僅僅是單一的一種疾病，而是多種疾病綜合在一起的表現(xiàn)。MS在祖國醫(yī)學(xué)中，并無明確的記載，根據(jù)其臨床特征，應(yīng)歸屬于中醫(yī)病證“眩暈”“濕阻”“消渴”“肥滿”“頭痛”等范疇。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為MS的病因病機(jī)是先天稟賦不足、嗜食肥甘、靜坐少動、憂思郁怒等導(dǎo)致脾失健運(yùn)，腎失蒸騰，肝郁氣滯，產(chǎn)生痰濁、水濕、瘀血、熱毒等[1-2]?，F(xiàn)代研究表明，糖尿病人群、MS等糖耐量受損人群等均與細(xì)胞周期素依賴性激酶5（CDK5）調(diào)節(jié)亞單位相關(guān)蛋白1類似物1（CDKAL1）基因、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）編碼基因的調(diào)節(jié)有關(guān)。本研究選取60例MS患者，按證型分為痰濕壅盛、氣陰兩虛兩組，探討CDKAL1與PPARG基因與痰濕瘀滯、氣陰兩虛MS患者的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1-6月福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院體檢篩查MS患者60例為試驗(yàn)組，選取同期體檢健康者30例為對照組。MS的診斷采用2005年國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）中心性肥胖（中國男性腰圍≥90 cm，女性腰圍≥80 cm）;（2）合并以下4項(xiàng)指標(biāo)中任2項(xiàng)：①甘油三酯（TG）水平升高，>150 mg/dL（1.7 mmol/L），或已接受相應(yīng)治療;②高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C）水平降低，男性<40 mg/dL（0.9 mmol/L），女性<50 mg/dL（1.1 mmol/L），或已接受相應(yīng)治療;③血壓升高：收縮壓≥130 mm Hg或舒張壓≥85 mm Hg，或已接受相應(yīng)治療或此前已診斷高血壓;④空腹血糖（FPG）升高，F(xiàn)PG≥100 mg/dL（5.6 mmol/L），或此前已診斷2型糖尿病或已接受相應(yīng)治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡60～65歲，性別不限;符合MS診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重的糖尿病、高血脂、高血壓、冠心病、腦血管病;慢性感染史及惡性腫瘤;有明顯的血常規(guī)、血生化及肝腎功能異常。按照證型將試驗(yàn)組隨機(jī)分為痰濕壅盛組、氣陰兩虛組，各30例。研究對象均對本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 四診材料收集 參照2002年《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[3]，2名合格的中醫(yī)專業(yè)人員經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)，按規(guī)范的方法負(fù)責(zé)收集中醫(yī)四診資料，將符合MS標(biāo)準(zhǔn)且診斷為痰濕瘀滯、氣陰兩虛兩類證型的患者納入研究。

1.2.2 血液采集 空腹至少8 h后于清晨采集患者外周血，用于檢測CDKAL1與PPARG基因的表達(dá)。

1.2.3 CDKAL1與PPARG基因檢測 空腹時，采集患者的靜脈血1 mL，用中量全血基因組RNA提取試劑盒提取外周血白細(xì)胞RNA，測定RNA的濃度和純度;將OD260/OD280值在1.8～2.0的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測定cDNA的濃度和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?采用Real-Time qQPCR法進(jìn)行檢測。（1）主要試劑：全基因組RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;SYBR Green Master mix購自TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Toyobo公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。（2）主要儀器：臺式冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 5415R）;超微量紫外分光光度計(jì)（美國Thermo Nano Drop 2000）;超低溫冰箱（美國Thermo U570）;梯度PCR擴(kuò)增儀（美國ABI Veriti TM）;熒光定量PCR儀（德國Eppendorf Mastercycler）。（3）引物的設(shè)計(jì)與合成：CDKAL1與PPARG和磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物序列由上海生工生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)并合成，詳細(xì)序列見表1。（4）RNA的提取與cDNA的合成：RNA的提取參照全血基因組RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行;紫外分光光度計(jì)定量，并鑒定RNA的純度;cDNA的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：RNA 2 μg，65 ℃ 5 min變性后，立即置于冰上冷卻，再加入5×RT Master Mix 4 μL，最后加Nuclease-free Water至終體積20 μL。PCR儀反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，52 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆?。?）實(shí)時熒光定量RT-PCR擴(kuò)增：采用SYBR GreenⅠ法，參照SYBR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行，以GAPDH為內(nèi)參基因，每個樣本的CDKAL1與PPARG基因和內(nèi)參GAPDH基因擴(kuò)增各重復(fù)3次。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，SYBR Master Mix 12.5 μL，上游引物及下游引物各1 μL，RNase-free Water 8.5 μL，共計(jì)25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，40個循環(huán);溶解曲線生成的反應(yīng)程序：95 ℃ 15 s，60℃ 15 s，95 ℃ 15 s。得出各反應(yīng)擴(kuò)增曲線和Ct值，以2-△△Ct表示試驗(yàn)組中目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）試驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組基線資料比較 對照組男14例、女16例，年齡（63.70±1.12）歲;痰濕壅盛組男17例、女13例，年齡（62.33±1.57）歲;氣陰兩虛組男15例、女15例，年齡（62.98±1.65）歲。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 各組CDKAL1、PPARG基因表達(dá)比較 痰濕壅盛、氣陰兩虛組CDKAL1、PPARG基因表達(dá)均高于對照組（P<0.000 1），且氣陰兩虛組CDKAL1基因表達(dá)高于痰濕壅盛組（t=2.72，P=0.01）;氣陰兩虛組PPARG基因表達(dá)高于痰濕瘀滯組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2和圖1。

3 討論

MS在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中并無相關(guān)記載，也沒有統(tǒng)一的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)，與“肥胖”“歷節(jié)”“消渴”等疾病相關(guān)?！端貑枴分刑岬剑骸澳晁氖?，而陰氣自半，起居衰矣?！标U釋了隨著年齡增長，壯年過后身體氣血衰弱、氣運(yùn)血行逐漸衰退，導(dǎo)致津液流通不暢，從而產(chǎn)生痰濁血瘀等病理產(chǎn)物的變化過程[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為MS是以胰島素抵抗為基礎(chǔ)[5]，臨床表現(xiàn)為中心性肥胖，并出現(xiàn)以高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂、糖代謝異常等聚集出現(xiàn)為特點(diǎn)的一組臨床癥候群[6]。劉才華等[7]研究表明，代謝綜合征與體質(zhì)指數(shù)、肥胖、血壓等密切相關(guān)，這與本研究所選擇的此類疾病高發(fā)人群作為研究對象相符合，而在治療方面，中醫(yī)學(xué)以整體觀念為指導(dǎo)，在本病的防治方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，顯示出整體調(diào)節(jié)、防治并重、副作用少等獨(dú)特的優(yōu)勢，因而備受青睞。對中醫(yī)證型與基因蛋白表達(dá)的關(guān)系進(jìn)行研究，可以為臨床辨證論治提供分子生物學(xué)依據(jù)。

CDKAL1基因位于人類染色體6p22.3，是編碼含539個氨基酸殘基的蛋白，在人類胰腺、骨骼肌細(xì)胞及腦組織中高度表達(dá)[8]。PPARG基因定位于3p25，屬于轉(zhuǎn)錄因子的核激素受體超家族，在調(diào)節(jié)胰島素靈敏性、脂肪細(xì)胞的分化及脂肪細(xì)胞特異基因的表達(dá)方面表現(xiàn)出重要的作用，可能參與MS的發(fā)生發(fā)展[9]。CDKAL1、PPARG基因可以使胰島細(xì)胞功能受損。多項(xiàng)研究表明，在健康人群、糖尿病人群、糖耐量受損人群，CDKAL1、PPARG不同的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）都與胰島素的分泌量有關(guān)，在MS發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著重要的作用。

該病病性本虛標(biāo)實(shí)，本虛則見氣虛、陰虛，標(biāo)實(shí)以痰濁、瘀血、熱郁為主，多累及肝、脾、腎三臟。研究發(fā)現(xiàn)，痰濕壅盛、氣陰兩虛是MS患者中常見的兩組證型[10]。同時，已有大量研究資料顯示MS與痰濕壅盛、氣陰兩虛存在密切關(guān)系[11-13]。肥胖體型多與氣虛、陽虛、痰濕、濕熱等證候相關(guān)[14]，而痰濕體質(zhì)者可兼血瘀[15]。消瘦體型多見于陰虛者，且伴有更多的瘀滯（血瘀）體質(zhì)[16-22]。因此，在本次研究中，分為對照組、痰濕壅盛組、氣陰兩虛組，均為60～65歲患者，結(jié)果顯示，痰濕壅盛、氣陰兩虛組CDKAL1、PPARG基因表達(dá)均高于對照組（P<0.000 1），且氣陰兩虛組CDKAL1基因表達(dá)高于痰濕壅盛組（P<0.05）;氣陰兩虛組PPARG基因表達(dá)高于痰濕瘀滯組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。張智明等[22]對MS與脂質(zhì)代謝、胰島素抵抗等生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行研究顯示其間存在明顯相關(guān)性，與本研究結(jié)果相似。筆者也考慮到可能由于氣陰兩虛的MS患者，由于病程前期多種病理產(chǎn)物積聚，化生郁熱者居多，暗耗陰液[17-20]。所以筆者得出，CDKAL1、PPARG兩種基因與MS患者呈一定關(guān)系，可能是老年氣陰兩虛MS患者的高危險(xiǎn)因子，對指導(dǎo)臨床治療有一定的意義，是MS證型研究的一種新視角;MS患者不同證型痰濕壅盛組、氣陰兩虛組CDKAL1、PPARG基因表達(dá)有所差異，原因可能與MS形成的病因病機(jī)有關(guān)：本虛標(biāo)實(shí)，正虛-脾腎氣虛，邪實(shí)-含痰濁、血瘀、肝胃郁熱、邪毒等。平素過食肥甘厚膩等食物，則可釀生痰濕，中年以后，臟氣逐漸衰退，其中尤以脾腎為主，腎精虧耗，腎虛難以氣化泄?jié)?脾氣不足，脾虛生濕，濕蘊(yùn)生熱，致痰濕熱毒趨下為患[21]。當(dāng)然本研究仍存在一定的局限性，首先樣本量相對較小，可能存在未測量的混雜因素;其次本研究雖然選擇MS的易感基因進(jìn)行檢測，但未能排除其他的易感因素的存在，并不能揭示MS證型與基因表達(dá)之間的直接因果關(guān)系。后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，擴(kuò)大研究對象人群，以及進(jìn)行縱向研究。

綜上所述，MS患者CDKAL1、PPARG基因表達(dá)均上調(diào)，與不同證型-痰濕壅盛與氣陰兩虛呈一定的相關(guān)關(guān)系。

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（收稿日期：2019-01-17） （本文編輯：董悅）