人角膜基質(zhì)間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及表型鑒定*

劉先寧，汪 耀，朱秀萍，程 燕，潘士印，肖湘華，銀 勇，安 娜，王亞妮，劉 睿

(西安市第一醫(yī)院，陜西省眼科研究所，陜西省眼科學(xué)重點實驗室，陜西省眼科疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，西北大學(xué)附屬第一醫(yī)院，西安 710002)

角膜位于眼前節(jié)，易受各種外傷、感染、酸堿燒傷等致病因素的傷害，嚴重者甚至可致盲。目前我國大約有400多萬角膜盲患者，因供體角膜材料極度匱乏，遠無法滿足患者的手術(shù)需求。另外，移植術(shù)后還面臨著免疫排異反應(yīng)等諸多問題，因此，急需尋找新的替代性手段預(yù)防及治療角膜盲。

近年來，隨著對間充質(zhì)干細胞的研究進展，基于其具有多向分化潛能、抗原性低、無成瘤性、具有對抗炎癥、免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點，國內(nèi)外研究者已開始探究其在眼部的應(yīng)用前景[1]。

本文報道一種人角膜基質(zhì)間充質(zhì)干細胞(HCS-MSC)分離培養(yǎng)及鑒定方法，為進一步在眼科基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 材料來源 人角膜緣組織來自于西安市眼科醫(yī)院、西安市眼庫角膜移植術(shù)后剩余的角膜緣組織。

1.3 實驗方法

1.3.2 HCS-MSC表型鑒定：①取傳代后的第三代細胞，棄上清，PBS清洗1次，用含0.2g/L EDTA和2.5 g/L胰蛋白酶的消化液消化2 min，終止消化，PBS清洗2次，用PBS制成濃度為1×107/ml細胞懸液。②取8支EP管，每管加100 μl細胞懸液，取一支做空白對照，其余7支分別加入抗人CD90-FITC，CD105-PE，CD29-FTTC，CD44-FITC，CD34-FITC和HLA-DR-PE的單抗5 μl，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次，空白對照加入500 μl PBS吹懸加入1號流式管，其余7支各加入1.5 ml PBS吹懸，每支平均分為3支加入流式管，然后上機檢測CD90，CD105，CD29，CD44，CD34，HLA-DR的表達情況。

2結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)的HCS-MSC形態(tài) 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)，4天后，從組織塊中及邊緣游離出細胞，倒置顯微鏡下，見亮晶晶的圓形細胞，逐漸成片，細胞變?yōu)樗笮巍⒍嘟切偷刃螒B(tài)，細胞核在胞體中央。至14天左右，融合生長達80%～90%。用胰酶消化傳代，傳代細胞生長形態(tài)均一，呈長梭形，細胞核為圓形或橢圓形，位于胞體中央(圖C為第2代)，具旋渦狀或放射狀干細胞生長特征(圖D為第3代)。見圖1。

注：A.原代培養(yǎng)第4天，從角膜緣基質(zhì)組織上及邊緣游離出成堆圓形晶亮的細胞，并已有梭形及桿狀細胞形成，左偏上為組織塊；B.原代培養(yǎng)第14天，細胞濃密成片，呈梭形，多邊形；C.傳代培養(yǎng)第2代，細胞呈均一梭形；D.傳代培養(yǎng)第3代，見旋渦狀或放射狀排列的細胞。

圖1分離培養(yǎng)的HCS-MSC鏡下形態(tài)(×100)

2.2 HCS-MSC表型鑒定結(jié)果 培養(yǎng)第3代細胞，表面CD90，CD105，CD29和CD44等間充質(zhì)干細胞系標(biāo)記均呈高表達，細胞陽性率分別為98.2%，99.5%，98.1%和100%。血系特異性表面分子CD34細胞陽性率僅為2.2%，HLA-DR僅為2.5%，見圖2。

圖2 HCS-MSC表型鑒定結(jié)果

3討論近年來，關(guān)于骨髓、脂肪、臍帶等來源的MSC研制及在眼部的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究已有不少報道[2-5]，但有關(guān)角膜組織來源MSC的研究相對較少，國內(nèi)罕見相關(guān)報道。

角膜90%以上由基質(zhì)組成，角膜基質(zhì)層含有大量規(guī)則排列的膠原纖維板和特異性細胞外基質(zhì) (extracellularm atrix，ECM)，對維持透明度起重要作用。位于纖維板層間的角膜基質(zhì)細胞可分泌多種特異性蛋白質(zhì)或多糖，在角膜微環(huán)境發(fā)生變化時，其生物學(xué)功能會隨之改變，甚至可以進行分化或轉(zhuǎn)化[6]，表明在角膜基質(zhì)細胞中具有干細胞性質(zhì)的細胞存在。

國內(nèi)樊廷俊等[7]指出，對調(diào)節(jié)因子及角膜基質(zhì)重建的研究表明，角膜基質(zhì)中可能含有成體干細胞，鑒定和分離出角膜基質(zhì)成體干細胞將在生物工程角膜構(gòu)建及角膜瘢痕患者的細胞治療方面起到重要作用。

近年來有研究表明，角膜基質(zhì)中的干細胞為間充質(zhì)干細胞，主要定位于角膜緣基質(zhì)前部靠近角膜緣干細胞(limbal stem cell，LSC)處，是角膜緣微環(huán)境組成部分，對維持LSC增生潛力起重要作用[8]，與角膜上皮、內(nèi)皮細胞共同維持基質(zhì)的透明與穩(wěn)定。

基于對角膜MSC研究及認識的不斷深入，本文取角膜移植術(shù)后剩余的人角膜緣組織，利用組織塊貼壁法，采用無血清間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液成功地分離培養(yǎng)出HCS-MSC，其細胞形態(tài)和免疫表型與文獻表述骨髓、人臍帶等其他組織來源的MSC非常相似[9-10]，可進行液氮低溫保存細胞株及傳代培養(yǎng)。該方法簡便、快速，材料來源于角膜移植后剩余的供體角膜緣組織，取材及處理材料相對容易，培養(yǎng)體系無動物源性成分，獲得的HCS-MSC，相對于其它組織來源的MSC種子細胞，在活性生物角膜構(gòu)建、移植及干細胞注射治療角膜病方面具有更大的轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。