種豬精液檢測(cè)中移液器的應(yīng)用

朱 丹 張鳳鳴 陳 東 潘紅梅*

（1.重慶市畜牧科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市養(yǎng)豬工程中心，重慶 402460；2.四川省蒼溪胰河鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站，四川蒼溪 628427）

隨著豬人工授精技術(shù)的普及，種豬常溫精液產(chǎn)品已被廣大養(yǎng)豬人接受。大部分小型豬場(chǎng)和散養(yǎng)戶已不再飼養(yǎng)種公豬，而是直接購(gòu)買制作好的種豬常溫精液用于配種。種豬常溫精液在生產(chǎn)前、生產(chǎn)后及使用前，都必須要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢查和評(píng)價(jià)，質(zhì)量合格的精液方能用于發(fā)情母豬輸配。其中，種豬精液稀釋前檢查原精的活力和原精的密度尤其重要。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《種豬常溫精液》（GB-23238-2009）的要求，原精稀釋后的種豬常溫精液產(chǎn)品精液劑量為80～100ml，精子活力≥60%，每劑量精液中直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)≥25億。其中每劑量中精子數(shù)以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)精子，獲得原精的密度值。檢測(cè)計(jì)算公式為：每劑量中精子數(shù)=5個(gè)中方格中的數(shù)子數(shù)×5（即25個(gè)中方格的總精子數(shù)）×10（1mm3內(nèi)的精子數(shù)）×1000（每毫升精液的精子數(shù)）×20（精液稀釋倍數(shù)）/50（根據(jù)原精密度大小調(diào)整）×劑量值。此計(jì)算公式可簡(jiǎn)化為：每劑量中精子數(shù)=5個(gè)中方格中的數(shù)子數(shù)×100萬(wàn)/250萬(wàn)×劑量值。由此計(jì)算公式可知，準(zhǔn)確取樣進(jìn)行檢測(cè)是確保獲得準(zhǔn)確的原精密度值，準(zhǔn)確確定精液稀釋倍數(shù)，保證種豬常溫精液產(chǎn)品質(zhì)量的基本前提。在取樣過(guò)程中，即使是很小的取樣誤差都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

傳統(tǒng)的玻璃取樣吸管或刻度管因其粗糙的制作、精度差和操作麻煩等原因已被精密度高，操作方便的微量移液器取代，目前，手動(dòng)微量移液器已被廣泛應(yīng)用于種豬精液抽樣和精液質(zhì)量檢測(cè)中。與所有的精密儀器一樣，若采用正確的操作技術(shù)使用移液器，并在使用過(guò)程中注意所有的操作細(xì)節(jié)，其結(jié)果有很強(qiáng)的可重復(fù)性。不幸的是，種豬常溫精液生產(chǎn)單位和質(zhì)量檢測(cè)單位的技術(shù)人員很少或根本沒(méi)有接受過(guò)規(guī)范的移液器操作和養(yǎng)護(hù)培訓(xùn)，在檢測(cè)過(guò)程中正確的移液器操作技術(shù)和必須注意的細(xì)節(jié)常被忽視，且移液儀器的定期校準(zhǔn)和適度保養(yǎng)基本被忽略。筆者長(zhǎng)期從事種豬精液質(zhì)量的檢測(cè)和抽檢工作，深感正確使用移液器的重要性和目前技術(shù)推廣中問(wèn)題的嚴(yán)重性，故總結(jié)此文，以供同行參考。

1 移液器的分類

自1956年德國(guó)科學(xué)家Heinrich·Schnitger發(fā)明可調(diào)式移液器至今，移液器已發(fā)展出繁多的種類，其分類方法也各不相同。

根據(jù)移液器的物理學(xué)原理可分為空氣置換式移液器（或氣體活塞式，Air displacement）和正向置換式移液器（或外置活塞式，Positive Displacement）兩種?？諝庵脫Q式移液器適用于標(biāo)準(zhǔn)溶液移液，例如水、緩沖液、稀釋的鹽溶液和酸堿溶液。其活塞位于移液器的內(nèi)部，通過(guò)活塞的伸縮改變空氣體積，同時(shí)產(chǎn)生壓力從而提供液體移動(dòng)原動(dòng)力即液體的吸取或排放，活塞與液體不接觸。正向置換移液器主要應(yīng)用于黏稠度較大的液體如糖漿、甘油等，易揮發(fā)溶液，易產(chǎn)生氣泡的液體的移液。需要配合專用的吸頭使用，其活塞位于移液器外，置于吸頭/毛細(xì)管內(nèi)部，通過(guò)活塞的伸縮引起液體的移動(dòng)?；钊c液體直接接觸，兩者之間沒(méi)有空氣段，可以更好地保護(hù)液體樣本，最大限度地避免交叉污染，能提高粘滯液體吸入或排出量的準(zhǔn)確性和精密度。

根據(jù)移液器所用動(dòng)力分，可分為手動(dòng)移液器和電動(dòng)移液器。根據(jù)移液器所帶吸頭的數(shù)量分，可分為單通道移液器和多通道移液器。

種豬精液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用的移液器為手動(dòng)單道移液器。這是一種量出式量器，其移液量是由一個(gè)配合良好的活塞在活塞套內(nèi)移動(dòng)的距離來(lái)確定。主要由顯示窗、容量調(diào)節(jié)部件、活塞、O-形環(huán)、吸引管和吸頭（也稱槍頭）等部分組成。

2 手動(dòng)單道移液器常用的移液技術(shù)

移液器的正確操作技術(shù)是完成合格檢測(cè)的第一步，錯(cuò)誤的操作容易產(chǎn)生移液偏差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。在精液檢測(cè)中因?yàn)樵♂尡稊?shù)大，取樣量小，檢測(cè)人員必須掌握正確的移液技術(shù)，減少檢測(cè)結(jié)果的誤差。

2.1 正向移液技術(shù)

空氣置換式移液器的操作按鈕有兩個(gè)位置：第一停點(diǎn)和第二停點(diǎn)。如圖1所示，當(dāng)使用正向移液技術(shù)吸液時(shí)，先用大拇指將操作按鈕按下到第一停點(diǎn)（1.準(zhǔn)備），再將移液吸頭浸入到樣品中，然后緩慢釋放操作按鈕回原點(diǎn)，吸入所需要的樣品量（2.吸液）。吸出樣品后，需要用吸水紙吸干吸頭外多余的樣品，以確保移出的樣品量為實(shí)驗(yàn)所需要的設(shè)定量。排液時(shí)，先將吸頭緊貼容器壁，按下操作按鈕到第一停點(diǎn)，排出吸頭內(nèi)的樣品（3.排放一）。為了讓吸頭內(nèi)的樣品全部排完，操作按鈕的第一停點(diǎn)稍加停頓后，還需繼續(xù)將操作按鈕按壓至第二停點(diǎn)（4.排放二），排盡吸頭內(nèi)所有樣品后再緩釋放操作按鈕回彈至原位，最后松開按鈕（5.復(fù)原）。

正向置換式移液器只能采用正向移液技術(shù)進(jìn)行操作。

圖1 正向移液技術(shù)操作示意圖

2.2 反向移液技術(shù)

反向移液技術(shù)一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的液體。

如圖2所示，當(dāng)使用反向移液技術(shù)吸液時(shí)，直接將操作按鈕壓至第二?？奎c(diǎn)（1.準(zhǔn)備），再將吸頭浸入樣品液面，同時(shí)控制操作按鈕緩慢回彈至原位，再松開操作按鈕，吸入所需要的樣品量（2.吸液）。排液時(shí)，先將吸頭緊貼容器壁，把操作按鈕按至第一停點(diǎn)，排出吸頭內(nèi)的樣品（3.排放），隨后將吸頭頂部剩余的樣品廢棄或還原至容器，釋放操作按鈕至原點(diǎn)（4.復(fù)原）。

圖2 反向移液技術(shù)操作示意圖

3 精液檢測(cè)中適用的移液器和移液技術(shù)

精液稀釋劑一般是普通的鹽溶液，可以用空氣置換式移液器和正向移液技術(shù)進(jìn)行操作。不推薦用反向移液技術(shù)移取水性溶液，因?yàn)檫@個(gè)技術(shù)在吸取水性溶液時(shí)，吸取的樣品量往往會(huì)超過(guò)儀器校準(zhǔn)時(shí)確定的量。

無(wú)論是原精還是稀釋精液都屬于黏性液體，在取樣移液時(shí)應(yīng)對(duì)其進(jìn)行特殊考慮。使用空氣置換式移液器和正向移液技術(shù)對(duì)精液樣品進(jìn)行取樣時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果，因?yàn)槲簳r(shí)，精液會(huì)在吸頭的內(nèi)壁形成一層薄膜，導(dǎo)致排液時(shí)樣品不能完全從吸頭內(nèi)排盡。因此，在移取精液樣品時(shí)推薦使用正向置換式移液器或空氣置換式移液器的反向移液技術(shù)。

移取精液樣品時(shí)，先將液體吸入，再打出，重復(fù)2～3次進(jìn)行吸頭浸潤(rùn)，致吸頭內(nèi)壁吸附一層液體，使吸頭內(nèi)表面達(dá)到飽和，最后將吸取的精液樣品移至目的容器，這樣操作吸取的樣品體積會(huì)更準(zhǔn)確，特別注意在排液前要仔細(xì)擦干凈吸頭外壁的液體。

4 精液檢測(cè)中的移液器使用技巧

4.1 量程的選擇和調(diào)節(jié)方法

首先要根據(jù)取樣量選擇合適量程的移液器。雖然移液器的可用量程范圍是移液器最大量程的10～100%，但移液體積越接近所選移液器的最大量程，移液的準(zhǔn)確性越好。如需要取樣70μl，最好選擇最大量程為100μl的移液器，而不用最大量程為200μl的移液器。

調(diào)節(jié)量程的正確方法應(yīng)為：當(dāng)移液器的量程需要從大體積調(diào)為小體積，按照正常的調(diào)節(jié)方法，即逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)旋鈕至目標(biāo)量程即可；當(dāng)移液器的量程需要從小體積調(diào)為大體積時(shí)，則可先順時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度旋鈕至超過(guò)目標(biāo)量程的刻度，再回調(diào)至目標(biāo)量程，這樣可以保證量取的最高精確度。這樣的操作可以排除移液器內(nèi)部機(jī)械間隙造成的影響，使移液更加準(zhǔn)確，而且整個(gè)調(diào)節(jié)過(guò)程要注意動(dòng)作輕緩。

特別注意，千萬(wàn)不能將調(diào)節(jié)旋鈕旋出量程，否則會(huì)卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞移液器。

4.2 吸頭填充方法

在精液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)人員常習(xí)慣將移液器下端垂直插入吸頭，并上下強(qiáng)力敲打吸頭，以期使吸頭緊密地填充上緊。但這種填充吸頭的方法會(huì)影響移液器的氣密性導(dǎo)致吸液不準(zhǔn)，長(zhǎng)期如此操作還會(huì)造成移液器內(nèi)部零件因經(jīng)常性的撞擊而松散，甚至?xí)?dǎo)致調(diào)節(jié)刻度的旋鈕卡住，影響移液器的使用。

填充吸頭的正確方法為將移液器下端垂直插入吸頭，左右小幅度旋轉(zhuǎn)上緊即可。

4.3 浸潤(rùn)吸頭有利于提高精液取樣準(zhǔn)確性

移取精液樣品時(shí)，由于精液有一定的黏稠度，會(huì)在吸頭上形成掛壁現(xiàn)象，因此移液時(shí)最好先潤(rùn)洗吸頭。具體方法是吸液時(shí)先將液體吸入，再打出，重復(fù)2～3次進(jìn)行吸頭浸潤(rùn)，這樣吸頭壁會(huì)吸附一層液體，使吸頭內(nèi)表面達(dá)到飽和，再吸液后排出的體積會(huì)更準(zhǔn)確。浸潤(rùn)過(guò)程還可以幫助檢查是否有氣密性不好導(dǎo)致的漏液現(xiàn)象。

吸液后，保持吸頭在液面下停留幾秒，使移液器的彈簧充分回彈至設(shè)定位置再把移液器拿出，可以提高吸液量的準(zhǔn)確性，避免因彈簧回彈不充分，吸頭下方進(jìn)入部分空氣和氣泡影響吸液的準(zhǔn)確性。

4.4 吸頭取樣角度和浸入深度

移液吸頭浸入液面的角度不同對(duì)移液效果也會(huì)有影響，劉麗[1]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明垂直加樣是準(zhǔn)確度最好的吸液角度。同樣移液吸頭浸入液體的深度對(duì)移液量也會(huì)有一定的影響。浸入過(guò)淺，可能會(huì)吸入空氣，導(dǎo)致移液量不準(zhǔn)；浸入過(guò)深，可能會(huì)因?yàn)轭~外增大的壓力致移液量偏高。劉麗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示吸頭浸入深度在4～10mm時(shí)比較，吸取血清、水、異戊醇和無(wú)水乙醇的變異系數(shù)分別為0.12、0.09、0.39和0.24，遠(yuǎn)小于浸入深度＜4mm和＞lOmm的結(jié)果。說(shuō)明移液時(shí)吸頭浸入液面達(dá)到4～10mm時(shí)吸液準(zhǔn)確性明顯提高。

4.5 吸頭吸液的速度

移液器取樣時(shí)吸液的速度也很關(guān)鍵，如果吸液過(guò)快會(huì)產(chǎn)生反沖和氣泡影響移液的準(zhǔn)確性，有的還會(huì)將液體吸入活塞，造成再次使用時(shí)交叉污染，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成移液器漏液，活塞和密封圈損壞。所以正確的操作應(yīng)該是緩慢吸液，這不僅可以使實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確還可以延長(zhǎng)移液器的使用壽命。

4.6 移液器的放置

移液器使用完畢，應(yīng)將量程調(diào)至最大刻度，再豎直掛在移液器架上。

當(dāng)移液器槍頭里有液體時(shí)，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。

5 精液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室移液器的維護(hù)與常見故障處理

在精液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中使用移液器需要適當(dāng)保養(yǎng)，且遇到常見故障要學(xué)會(huì)處理。

（1）氣密性檢測(cè) 將吸取液體后的移液器垂直靜置15s，觀察是否有液滴緩慢的流出。若有流出，說(shuō)明有漏氣現(xiàn)象。

（2）移液器漏氣的處理 如果有漏液則更換吸頭后再試，如果繼續(xù)漏液須更換移液器再操作。漏液的移液器需送到專業(yè)部門進(jìn)行檢修。

（3）準(zhǔn)確性檢測(cè)

量程小于1μl：建議使用分光光度法檢測(cè)。

量程大于1μl：用稱重法檢測(cè)。通過(guò)對(duì)水的稱重，轉(zhuǎn)換成體積來(lái)鑒別移液器的準(zhǔn)確性。

送至有資質(zhì)的計(jì)量監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)作專業(yè)校準(zhǔn)。