舌鱗狀細(xì)胞癌中Bmi-1和P16的表達(dá)及對(duì)癌細(xì)胞侵襲的調(diào)控作用

李斌 王芳 李詠 蔡揚(yáng)

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)具有較高的侵襲力和早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，盡管目前治療TSCC方面的診療技術(shù)在不斷的提高，但是TSCC患者的預(yù)后仍然不佳，究其原因與TSCC的區(qū)域性和遠(yuǎn)處淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。B細(xì)胞淋巴瘤濾過(guò)性病毒插入位點(diǎn)1(B cell-specific moloney leukemia virus insert site-1，Bmi-1)目前已經(jīng)被證實(shí)屬于致癌基因，其在腫瘤的發(fā)展過(guò)程著扮演著重要角色，Bmi-1的高表達(dá)與人類多種腫瘤如胰腺癌、乳腺癌等的預(yù)后不良有關(guān)[2-3]，此外，Bmi-1還可以促進(jìn)黑色素瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，促進(jìn)腫瘤的侵襲和遷移[4]，但目前關(guān)于Bmi-1在TSCC中的表達(dá)及調(diào)控TSCC侵襲的作用及機(jī)制報(bào)道不多，本研究綜合TSCC臨床病理及細(xì)胞研究，探討B(tài)mi-1在TSCC侵襲過(guò)程中的作用及可能機(jī)制，為TSCC的臨床治療研究提供可能靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病理標(biāo)本

本實(shí)驗(yàn)所需53 例TSCC石蠟標(biāo)本均來(lái)自于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔診療中心，所有TSCC標(biāo)本均為腫瘤原發(fā)灶，其中高分化33 例、中低分化20 例，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組34 例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組19 例。Ⅰ～Ⅱ期12 例，Ⅲ～Ⅳ期41 例。本研究由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞系

舌鱗癌細(xì)胞株(CAL27)由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.3 試劑

兔抗人Bmi-1多克隆抗體(Santa Cruz，美國(guó))；MMP9單克隆抗體(CST，美國(guó))；SP免疫組化試劑盒及DAB染色試劑盒(中杉金橋)；GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、鼠抗人P16單克隆抗體(福州邁新)；Bmi-1抑制劑PTC-209(Selleck，美國(guó))；Traswell小室等(Coring，美國(guó))；本實(shí)驗(yàn)余所用實(shí)驗(yàn)儀器均由湖南醫(yī)藥學(xué)院生物研究中心提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 免疫組化 嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照組，工作濃度Bmi-1(1∶150)，p16(1∶50)。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]：Bmi-1陽(yáng)性為TSCC細(xì)胞核染棕黃色或者棕褐色顆粒，胞漿也可有少量棕黃色樣顆粒，P16陽(yáng)性為TSCC細(xì)胞核染棕黃色樣顆粒，胞質(zhì)中也可有淡黃染色。最后結(jié)果判定用染色強(qiáng)度和染色百分比進(jìn)行評(píng)估：染色強(qiáng)度：陰性染色1分，弱染色2分，中等強(qiáng)度染色3分，強(qiáng)染色4分；染色百分比：陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度和百分比的乘積判定結(jié)果，分?jǐn)?shù)≤4分為(-)，5分以上為(+)。上述結(jié)果至少由兩位病理科醫(yī)生在雙盲情況下觀察所判定。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng) TSCC細(xì)胞(CAL27)接種于含12% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè) Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清培養(yǎng)基按照1∶5配比，然后取60 μl均勻鋪于Transwell小室的上室中，計(jì)數(shù)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度約為4×108個(gè)/L，上室加入終濃度為10 μmpl/L的抑制劑PTC-209處理TSCC細(xì)胞，小室下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基，24 h后無(wú)菌棉簽拭去上室多余細(xì)胞和基質(zhì)膠，PBS沖洗，再甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，于倒置相差顯微鏡下取4 個(gè)視野拍照并計(jì)算細(xì)胞數(shù)目。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) Bmi-1抑制劑PTC-209處理后相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 應(yīng)用10 μmol/L Bmi-1抑制劑PTC-209處理TSCC細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，冰上裂解，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)蛋白濃度定量及水浴變性后行SDS電泳分離蛋白，PVDF膜濕轉(zhuǎn)后，5% BSA封閉2 h，再加入Bmi-1(1∶1 000)、P16(1∶500)、MMP9(1∶1 000)一抗4 ℃恒溫冰箱過(guò)夜，次日用二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，儀器掃描記錄。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 Bmi-1、P16在TSCC組織中的表達(dá)

檢測(cè)結(jié)果如圖 1、表 1。53 例TSCC病理組織切片中，Bmi-1(+)有34 例(64.15%)，Bmi-1染色強(qiáng)度與臨床分期(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)相關(guān)，與分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，P16(+)有25 例(47.17%)，P16染色強(qiáng)度與臨床分期(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)相關(guān)，與分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。

2.2 Bmi-1/P16表達(dá)與TSCC臨床病理因素的相關(guān)性

如表 2所示：在53例TSCC病理切片中，Bmi-1表達(dá)陽(yáng)性合并P16表達(dá)陰性的TSCC病理組織染色強(qiáng)度與臨床分期(P<0.05)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)相關(guān)，而與分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)，表 3中再通過(guò)Spearman法分析二者相關(guān)性顯示Bmi-1與P16的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性(r=-0.555，P<0.05)。

2.3 PTC-209對(duì)TSCC細(xì)胞侵襲能力的影響

如圖 2所示：應(yīng)用抑制劑PTC-209處理TSCC細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組比較，抑制劑處理組舌鱗癌細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(P<0.001)，提示抑制Bmi-1的表達(dá)能降低舌鱗癌細(xì)胞的侵襲能力。

2.4 PTC-209處理TSCC細(xì)胞Bmi-1、P16及MMP9蛋白表達(dá)的影響

應(yīng)用Bmi-1抑制劑PTC-209處理TSCC細(xì)胞后，Bmi-1蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.001)，P16蛋白表達(dá)升高(P<0.001)，MMP9表達(dá)被抑制(P<0.01)(圖 3)。

表 1 Bmi-1、P16的表達(dá)與臨床病理因素間的關(guān)系

注： ①P<0.05

圖 1 Bmi-1與P16在TSCC組織中表達(dá)情況 (SP， ×400)

Fig 1 Bmi-1 and P16 expression in tongue squamous cell carcinoma (SP， ×400)

表 2 Bmi-1/P16表達(dá)與TSCC臨床病理因素的關(guān)系

Tab 2 Relationship between co-expression of Bmi-1 and P16 and clinicopathological factors

臨床病理因素nBmi-1(+)/P16(-)χ2P值組織學(xué)分級(jí) 高分化33140.7900.374中/低分化2011淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無(wú)1948.1070.004①有3421臨床分期 Ⅰ/Ⅱ1219.3890.002①Ⅲ/Ⅳ4124

注： ①P<0.05

表 3 TSCC中Bmi-1與P16表達(dá)的相關(guān)性

Tab 3 Analysis of the correlation between Bmi-1 and P16 expression in TSCC

Bmi-1(-)(+)r值P值P16(-)325-0.5550.000①P16(+)169

3 討 論

Bmi-1基因是屬于PCG(polycomb-group)家族的重要成員之一，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，廣泛參與多種腫瘤的增殖，干細(xì)胞的自我更新等活動(dòng)[6-7]。目前已經(jīng)被證實(shí)，在乳腺癌、胰腺癌等腫瘤

圖 2 TSCC細(xì)胞中Bmi-1表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 (×100)

Fig 2 The effect of Bmi-1 on the ivasion of TSCC cells (×100)

圖 3 抑制劑PTC-209對(duì)Bmi-1、P16和MMP9表達(dá)影響

Fig 3 The effect of inhibitor PTC-209 on the expression of Bmi-1, P16 and MMP9

中Bmi-1往往處于高表達(dá)水平，通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默Bmi-1，可以降低腫瘤的惡性生物學(xué)行為，達(dá)到抑制腫瘤的作用[4,6]。目前關(guān)于Bmi-1的表達(dá)與腫瘤臨床病理因素的關(guān)系報(bào)道有差異，Vonlanthen等[8]研究非小細(xì)胞肺癌的患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，有58%病理組織中Bmi-1的高表達(dá)與腫瘤的分化程度、組織學(xué)分類以及患者預(yù)后無(wú)關(guān)；而Bmi-1在胃腸道間質(zhì)瘤中高表達(dá)，與胃腸道間質(zhì)瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)患者5 年生存率等相關(guān)[9]。本實(shí)驗(yàn)在研究TSCC時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，Bmi-1的高表達(dá)與TSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，與分化程度無(wú)關(guān)。P16蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制物，在淋巴瘤等等都有檢測(cè)到P16表達(dá)突變或者缺失，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生[10]。P16在腫瘤組織中的表達(dá)豐度，可以作為宮頸癌，胰腺癌癌前病變或癌變的重要指標(biāo)，為患者的預(yù)后提供參考[11]。本研究中，應(yīng)用免疫組化法染色TSCC組織發(fā)現(xiàn)，P16的低表達(dá)(或失表達(dá))與TSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)，與分化程度無(wú)關(guān)。

關(guān)于Bmi-1與P16的關(guān)系，Wang等[9]研究胃腸道間質(zhì)瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)組織中Bmi-1高表達(dá)的同時(shí)也可伴有P16的低表達(dá)，且相關(guān)性分析顯示二者呈負(fù)相關(guān)性，而本實(shí)驗(yàn)也有類似的發(fā)現(xiàn)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Bmi-1表達(dá)陽(yáng)性合并P16表達(dá)陰性的舌鱗癌組織中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高，同樣地臨床分期Ⅲ/Ⅳ組較Ⅰ/Ⅱ組高，這提示Bmi-1和P16可能共同參與了舌鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，二者可能具有疊加效益。

Bmi-1的高表達(dá)作為腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)，其廣泛參與腫瘤的增殖，干細(xì)胞的自我更新，甚至參與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤的侵襲[6]。前面免疫組化發(fā)現(xiàn)P16的失表達(dá)與TSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而上調(diào)P16的表達(dá)，可以抑制肝細(xì)胞癌的侵襲能力；Bmi-1作為P16的上游基因，其可以通過(guò)抑制P16的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，這些都提示，在腫瘤侵襲甚至發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過(guò)程中Bmi-1和P16均有參與。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族主要成員之一，其可以降解腫瘤基底膜的主要成分(IV型膠原蛋白)，并在腫瘤血管化、侵襲以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著主要的作用[12]。本研究為證明Bmi-1對(duì)舌鱗癌侵襲的作用，再以舌鱗癌細(xì)胞株為研究對(duì)象，應(yīng)用Bmi-1抑制劑處理舌鱗癌細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，舌鱗癌細(xì)胞的侵襲能力顯著降低，這表明Bmi-1的表達(dá)能促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的侵襲，進(jìn)而影響舌鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期等。為進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白印記法檢測(cè)抑制劑PTC-209處理細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)變化，舌鱗癌細(xì)胞Bmi-1表達(dá)下降，P16表達(dá)上調(diào)，此外MMP9表達(dá)抑制，而這表明Bmi-1可通過(guò)抑制P16蛋白或上調(diào)MMP9蛋白，從而促進(jìn)舌鱗癌細(xì)胞的侵襲。

綜上所述，Bmi-1的表達(dá)與舌鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)，Bmi-1和P16在TSCC中的表達(dá)異常，可能共同參與了舌鱗癌的侵襲過(guò)程，Bmi-1可通過(guò)下調(diào)P16，上調(diào)MMP9促進(jìn)舌鱗癌的侵襲。