上海動(dòng)物園三種野生禽類新城疫免疫效果評(píng)估

王瑛瑩 陳曉蘭 桂劍峰 朱向蕾 陸旖旎 袁耀華

(上海動(dòng)物園，上海，200335)

雞(Gallusgallusdomesticus)新城疫(Neweastle disease，ND)是一種高度接觸性致死性傳染病，是當(dāng)前危害禽類最嚴(yán)重的傳染病之一，[1-3]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類動(dòng)物疫病。新城疫病毒(NDV)可感染50個(gè)鳥目(Aves)中27個(gè)目240種以上的禽類，主要感染雞、鴿(Columbidae)、鵪鶉(Coturnixjaponica)、火雞(Meleagrisspp.)等[4]。近年來(lái)，其宿主范圍有擴(kuò)大的趨勢(shì)，鵝鴨等水禽也可感染發(fā)病[5-6]。因此，應(yīng)當(dāng)對(duì)新城疫病毒對(duì)野生禽類及人類健康的威脅引起重視。

上海動(dòng)物園圈養(yǎng)野生禽類種類豐富，目前有鳥類近20個(gè)目，200余種供游客觀賞，且每年會(huì)有外來(lái)野生鳥類在此棲息。因此，上海動(dòng)物園具有NDV傳播和爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)隨時(shí)監(jiān)測(cè)新城疫疫情，并充分做好免疫防控的監(jiān)測(cè)工作[7-8]。目前，疫苗免疫是防控野禽新城疫的主要措施[9]。上海動(dòng)物園針對(duì)新城疫每年春秋兩季對(duì)圈養(yǎng)野禽進(jìn)行疫苗免疫，然而，上海動(dòng)物園現(xiàn)行免疫程序下現(xiàn)用家禽疫苗對(duì)野生禽類的保護(hù)作用尚不清楚。為了查明現(xiàn)用NDV疫苗對(duì)上海動(dòng)物園野生禽類的保護(hù)效果，本文就上海動(dòng)物園2017年度野生禽類新城疫疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)估，以期為野生禽類新城疫疾病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取上海動(dòng)物園圈養(yǎng)的3種不同的野生禽類共48只，其中東方白鸛(Ciconiaboyciana)11只，孔雀(Pavospp.)25只，白鷴(Lophuranycthemera)12只。所有的野禽于2017年3月進(jìn)行新城疫疫苗免疫。

1.1.2 疫苗

雞新城疫滅活疫苗(CLONE30株)為英特威國(guó)際有限公司產(chǎn)品；MA5+CLONE30新支二聯(lián)弱毒苗由英特威國(guó)際有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 檢測(cè)試劑

新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原、陽(yáng)性血清，均購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司。紅細(xì)胞懸液按照GB/T 18936—2003標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行制備。

1%雞紅細(xì)胞懸液由本實(shí)驗(yàn)室制備，具體如下：采集3只無(wú)新城疫抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH 7.2的0.01 mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1 000 r/min離心10 min，洗滌后用PBS配成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 疫苗免疫

采用滅活疫苗肌肉注射和弱毒疫苗點(diǎn)眼免疫的聯(lián)合免疫方式對(duì)野禽進(jìn)行免疫。具體如下：使用雞新城疫滅活疫苗(CLONE30株)進(jìn)行肌肉注射，根據(jù)野禽體重大小疫苗接種量為0.5—2 mL/羽；同時(shí)使用2頭份/羽的免疫劑量點(diǎn)眼免疫M(jìn)A5+CLONE30新支二聯(lián)弱毒苗。所有免疫野禽都套上腳標(biāo)，做好編號(hào)。

1.2.2 血清采集

免疫前和免疫后21 d、30 d、60 d、120 d和180 d按時(shí)對(duì)免疫禽無(wú)菌采集血液，分離血清，冷凍保存。

1.2.3 抗體檢測(cè)

新城疫HI抗體檢測(cè)按照GB/T 16550—2008新城疫診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)行血清抗體水平的測(cè)定。結(jié)果判定：以完全抑制4個(gè)血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價(jià)，只有陰性對(duì)照孔效價(jià)不大于2 log2，陽(yáng)性對(duì)照孔效價(jià)誤差不超過(guò)1個(gè)滴度時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果才有效。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，新城疫HI效價(jià)≥4 log2判為免疫合格。

2 結(jié)果和討論

2.1 血液樣品采集程序、疫苗免疫

上海動(dòng)物園新城疫疫苗免疫程序?yàn)槊堪肽昝庖?次，分為春季免疫和秋季免疫，兩次免疫所使用的疫苗和免疫程序均相同。血液樣品采集分為6個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別在春季免疫前，免疫后21 d、30 d、60 d、120 d和180 d。血液樣品采集及免疫程序見圖1。

2.2 免疫前和免疫后180 d內(nèi)新城疫抗體滴度分析

對(duì)東方白鸛、孔雀和白鷴的新城疫抗體滴度監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在所有的監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)，新城疫抗體滴度個(gè)體雖差異較大，但均達(dá)到國(guó)家要求的最低標(biāo)準(zhǔn)(4 log2)。東方白鸛、孔雀和白鷴總體平均抗體滴度分別為(7.45±1.49)log2、(9.09±1.61)log2和(8.70±1.24)log2。

圖1 上海動(dòng)物園免疫及采血程序Fig.1 The immunization procedure and blood collection point

表1 新城疫病毒抗體滴度檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The antibody titers against Newcastle disease virus

續(xù)表1

注：“/”表示因樣品采集不全未進(jìn)行檢測(cè)；抗體平均值表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差
Note：“/”Indicates that the test was not performed.The mean value of the antibody titers：mean value±standard deviation

圖2 野禽新城疫病毒抗體滴度變化曲線Fig.2 The curve of the NDV antibody titers on wild fowls

2.3 NDV免疫365 d后抗體狀態(tài)

上海動(dòng)物園園內(nèi)展出動(dòng)物按照現(xiàn)階段的免疫程序進(jìn)行接種疫苗，故對(duì)展出動(dòng)物抗體滴度監(jiān)測(cè)最多持續(xù)180 d，隨后動(dòng)物即進(jìn)入下一個(gè)免疫程序。為了進(jìn)一步了解180 d后相關(guān)野禽的新城疫的抗體水平，另選取11只孔雀和6只東方白鸛為研究對(duì)象，對(duì)單次免疫后12個(gè)月和15個(gè)月的新城疫抗體滴度進(jìn)行檢測(cè)(圖3A)，具體抗體滴度信息見表2。

表2 免疫365 d后孔雀和東方白鸛抗體滴度Tab.2 The NDV antibody titers of the peacock and Oriental stork over 365 days

圖3 NDV免疫后12個(gè)月和15個(gè)月野鳥抗體滴度分析A.免疫及采血程序；B.孔雀和東方白鸛NDV抗體滴度分析。*表示P<0.05Fig.3 Analysis of antibody titers at 12 and 15 months after immunizationA.The immunization procedure and blood collection point.B.The NDV antibody titers of the peacoke and Oriental stork.*Indicates P<0.05

3 討論與分析

免疫后應(yīng)激反應(yīng)是疫苗效果評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，疫苗免疫后對(duì)本項(xiàng)目中3種野禽(東方白鶴、孔雀和白鷴)的生活狀態(tài)進(jìn)行觀察，經(jīng)過(guò)連續(xù)3周觀察發(fā)現(xiàn)，新城疫疫苗注射未對(duì)野禽的飲食、運(yùn)動(dòng)等行為造成較大影響，無(wú)野禽死亡。每次采血后，對(duì)采血?jiǎng)游镞M(jìn)行3—5 d觀察，未發(fā)現(xiàn)較大的應(yīng)激反應(yīng)。

目前，動(dòng)物園一般都采用滅活苗和弱毒苗聯(lián)合免疫的方式來(lái)預(yù)防新城[10-11]。滅活油苗能不斷地刺激機(jī)體產(chǎn)生高濃度的抗體，且維持時(shí)間很長(zhǎng)，但刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體所用的時(shí)間需要14—20 d，所以，它引起的抗體空白期長(zhǎng)[12]。弱毒苗免疫后能在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生免疫作用，刺激黏膜免疫，但免疫產(chǎn)生的抗體濃度低[13]。溫榮輝等[14]報(bào)道的孔雀養(yǎng)殖場(chǎng)單獨(dú)使用ND三價(jià)弱毒苗進(jìn)行免疫免疫后發(fā)生新城疫疫情；張玲莉等[15]報(bào)道的單獨(dú)使用新支二聯(lián)弱毒苗免疫后70 d孔雀的平均抗體滴度是4.7 log2，接近有效保護(hù)水平臨界值。本研究中弱毒苗和滅活苗聯(lián)合使用，接種后21 d孔雀抗體滴度是9.93 log2，120 d孔雀抗體滴度是9.27 log2，抗體水平高且均勻，并且免疫期比單獨(dú)使用弱毒活疫苗要長(zhǎng)。這表明上海動(dòng)物園采用的滅活疫苗和弱毒疫苗聯(lián)合免疫防控新城疫可行有效。

本研究中，新城疫疫苗免疫后，東方白鸛、白鷴和孔雀新城疫抗體滴度呈現(xiàn)先升高后逐漸降低的過(guò)程(圖2)。值得注意的是，在相同的疫苗接種程序和類似的飼養(yǎng)條件下，3種野禽新城疫抗體滴度存在較大差異，孔雀的新城疫抗體滴度最高，白鷴次之，東方白鸛新城疫抗體滴度最低，且3種野禽達(dá)到滴度峰值的時(shí)間是不同的，表明所使用的疫苗對(duì)3種野禽免疫效果存在一定差異。

對(duì)免疫后3種野禽新城疫抗體滴度橫向比較發(fā)現(xiàn)，東方白鸛新城疫整體抗體水平明顯低于孔雀和白鸛。此外，雖然經(jīng)疫苗免疫后東方白鸛新城疫抗體均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但東方白鸛65次有效檢測(cè)中，21次抗體滴度小于或等于6 log2，僅略高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)5 log2。應(yīng)排查造成東方白鸛新城疫抗體滴度低的原因，并根據(jù)原因優(yōu)化調(diào)整東方白鸛的新城疫接種程序。應(yīng)加強(qiáng)東方白鸛新城疫抗體水平監(jiān)測(cè)并在免疫接種時(shí)予以重點(diǎn)關(guān)注。

免疫程序的制定是因機(jī)體的免疫應(yīng)答能力而定，經(jīng)過(guò)此次抗體監(jiān)測(cè)可知，不同種屬的野禽注射疫苗后，抗體滴度是有差異的。種屬間表現(xiàn)出的差異可能與其生理結(jié)構(gòu)和自身的免疫機(jī)制不同有關(guān)，相關(guān)問(wèn)題還有待深入研究探討。因此，對(duì)于野生禽類來(lái)說(shuō)，若要達(dá)到疫苗的免疫效果和有效的保護(hù)時(shí)間，需針對(duì)不同種屬制定合理的免疫程序。上海動(dòng)物園采用的新城疫免疫程序能夠使東方白鸛、孔雀、白鷴等野禽產(chǎn)生符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的抗體滴度。疫苗免疫后180 d，東方白鸛、孔雀、白鷴的新城疫抗體滴度分別為7.13 log2、9.15 log2、7.72 log2；即使免疫后15個(gè)月，抗體水平仍然符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。建議延長(zhǎng)兩種疫苗的免疫間隔，以減少野禽抓捕和疫苗接種引起的應(yīng)激反應(yīng)并降低疾病防控經(jīng)濟(jì)成本。