烏蘇里蝮罹患間葉型軟骨肉瘤研究

路生鑫 李丕鵬 王珊珊 姚晨昊 程建鑫 周正彥 陸宇燕*

(1.沈陽師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽，110034；2.青島奧克生物開發(fā)有限公司，青島，266111)

蛇，作為一種很少群居的生命體，在野外時(shí)常發(fā)現(xiàn)死亡的個(gè)體，但其死因很難鑒定。動(dòng)物園是很多野生動(dòng)物的樂園，有著良好的管理措施和詳盡的記錄。因此，目前關(guān)于蛇類的疾病報(bào)道大部分均來自于動(dòng)物園的研究報(bào)道[1-2]。但隨著蛇產(chǎn)品的不斷開發(fā)，對(duì)蛇的需求也隨之猛增。而國內(nèi)大量的蛇類養(yǎng)殖場(chǎng)，最棘手的問題就是如何提高對(duì)蛇類疾病的預(yù)防和治療。雖然已有很多養(yǎng)殖者和科研人員對(duì)蛇類疾病進(jìn)行了普查、治療和預(yù)防工作，但主要集中于蛇類的皮膚病、口腔炎、肺炎、腸炎，體表和體內(nèi)寄生蟲等方面[3-4]。關(guān)于蛇類腫瘤報(bào)道極少，國內(nèi)僅見對(duì)圓斑蝰(Daboiarusselii)橫紋肌肉瘤的報(bào)道，國外報(bào)道也不多見[5]。

烏蘇里蝮(Gloydiusussuriensis)是東北地區(qū)常見毒蛇，由于其蛇毒具有特殊的藥用價(jià)值[6]，野外種群近年來呈急劇下降的趨勢(shì)。雖然國內(nèi)已開展了探索人工養(yǎng)殖模式，以緩解對(duì)野外種群的生存壓力，但在大規(guī)模高密度的飼養(yǎng)情況下，烏蘇里蝮的生長情況并非理想，死亡率得不到有效控制。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)人工養(yǎng)殖的烏蘇里蝮健康情況做了初步調(diào)查，首先對(duì)已經(jīng)表現(xiàn)出生長不良、體表有異物突起、蛻皮困難、喂食后吐食的個(gè)體進(jìn)行了較為系統(tǒng)的解剖觀察。本文對(duì)頸部有異常突起的烏蘇里蝮進(jìn)行系統(tǒng)檢查，希望能更多地了解病況，積累一些相關(guān)疾病的基礎(chǔ)資料，為后面的深入研究打下科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用烏蘇里蝮，由沈陽斯納可蛇類養(yǎng)殖有限公司提供，均為在飼養(yǎng)場(chǎng)喂養(yǎng)一年以上的成年蛇(健康蛇6條，具腫瘤蛇6條)。

1.2 方法

用乙醚將蛇麻醉后，首先進(jìn)行體重、體長的測(cè)量(體重測(cè)量：Mettler ToledoQ/OAFA02—2009電子天平，精確度：0.1 g；長度測(cè)量：哈爾濱量具廠GB/T14899—94電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺，測(cè)量范圍150 mm，精確度0.01 mm)。尾靜脈取血后，自泄殖腔處剖開腹壁進(jìn)行大體解剖，觀察各器官色澤和形態(tài)，稱量相關(guān)器官以及蛇的胴體重量。尾靜脈取血1.5 mL，離心(上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-16G-C高速臺(tái)式冷凍離心機(jī))后取分離血漿，取血清送沈陽艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。尾靜脈取血0.1 mL，利用BM21B半自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。解剖后剝離的器官和腫塊均固定于10%的中性福爾馬林溶液。常規(guī)石蠟切片(厚度7 μm)，分別進(jìn)行HE(Olympus BX5顯微鏡和Olympus DP71攝像頭觀察拍照)和免疫組化染色。免疫組化采用EnVision二步法，DAB染色。S100、VIM、EMA和GFAP的免疫組化標(biāo)記的操作步驟按說明書進(jìn)行，所有抗體試劑購自沈陽鼎國生物技術(shù)公司。

1.3 計(jì)算公式

肥滿度=蛇胴體重(g)×100/體長3(cm3)；

各器官系數(shù)=器官重量/蛇胴體重量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，相關(guān)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。設(shè)置P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 蛇瘤體描述

編號(hào)為F20160759烏蘇里蝮頸部明顯的隆起(圖1a)。剖開頸部皮膚后，可見脖頸部有一大一小前后兩個(gè)腫塊，兩者各自有獨(dú)立的被膜包裹，腫塊之間以及腫塊與氣管之間較易分離(圖1b、1c)，但腫塊與食道之間的剝離略顯困難。腫塊表面光滑，整體呈淡肉紅，局部呈明顯的淡黃色板塊，可見有豐富的毛細(xì)血管分布于漿膜下。手觸感覺腫塊整體較硬，切面呈乳白色，隱約可見散在的小孔狀結(jié)構(gòu)。其他有腫瘤烏蘇里蝮脖頸部不同程度存在著數(shù)個(gè)腫塊(編號(hào)F20170101圖1d)，但其體積明顯小于前者(F20160759)，顏色均為乳白色，其他特征與前一條類似。

由表1可見，正常蛇與腫瘤蛇在肝系數(shù)和腎系數(shù)兩種數(shù)據(jù)上無顯著性差異(P>0.05)，在肥滿度上正常蛇與腫瘤蛇呈顯著性差異(P<0.05)，而在脂肪體系數(shù)上正常蛇和腫瘤蛇呈極顯著性差異(P<0.01)。

圖1 烏蘇里蝮解剖圖 a.F20160759烏蘇里蝮頸部側(cè)面觀；b-c.F20160759頸部腫瘤腹面觀及剝離狀態(tài)；d.F20170101頸部腫瘤腹面觀Fig.1 The anatomies of Gloydius ussuriensis a.The lateral view of F20160759 neck region.b-c.The ventral view and stripping state of the tomours in F20160759.d.The ventral view of the tomours in F20170101

表1 烏蘇里蝮的一般形態(tài)學(xué)測(cè)量指標(biāo)Tab.1 General morphological measurements of Gloydius ussuriensis

注：P≥0.05為不顯著，*0.01≤P<0.05為顯著，**P<0.01為極顯著
Note：P≥0.05 is not significant between data，0.01≤P<0.05 *show the data is significant different，P<0.01 **show the data is very significant

2.2 組織學(xué)觀察

在腫塊的整體橫切面上可見，腫塊漿膜較??；沒有被結(jié)締組織間隔形成明顯的“小葉”結(jié)構(gòu)；在腫塊的邊緣可見小血管分布，但在腫塊內(nèi)部未見典型的血管結(jié)構(gòu)。腫塊內(nèi)部可明顯劃分為2個(gè)區(qū)域：軟骨區(qū)和病灶區(qū)即“癌穴”(圖2a)。

2.2.1 軟骨區(qū)

由組織學(xué)切片可見，腫瘤的大部分均由軟骨組織構(gòu)成(圖2b)，可見正常的軟骨陷窩，軟骨囊深染，邊界清晰，其中有2—4個(gè)軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞圓形或橢圓形，均呈收縮狀態(tài)，大小僅為軟骨囊顯示的50%以下，其余軟骨囊中充填或多或少的淡藍(lán)紫色物質(zhì)，或者呈空泡狀(圖2c)。軟骨細(xì)胞胞質(zhì)呈較強(qiáng)的嗜堿性，胞核深染、均勻，一般位于細(xì)胞中央，也有個(gè)別偏位。軟骨囊的排列松散，相互之間甚至出現(xiàn)很大的空隙，而在空隙周圍的軟骨細(xì)胞成明顯的皺縮或破裂(圖2d)，并可見部分軟骨陷窩邊緣有增厚的藍(lán)紫色區(qū)域。在少數(shù)區(qū)域有類似病變的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)，整個(gè)區(qū)間在HE染色中呈淡紫色，其間可見各種類型血細(xì)胞的核，而細(xì)胞質(zhì)膨大淡染。在一些間隙中可見大量的淋巴細(xì)胞(圖2e)或嗜酸性顆粒細(xì)胞的存在(圖2f)。在一些區(qū)域軟骨陷窩很少，可見有多數(shù)的胞核，胞質(zhì)邊緣模糊，含有較多的嗜酸性顆粒細(xì)胞，纖維成分明顯，周邊還有較多、較大的淡紫藍(lán)的鈣化斑塊存在(圖2f)。

2.2.2 癌穴

由圖2a可見，有大小不一的圓形或橢圓形的癌穴分布其中，在腫塊的橫切面中其整體面積占腫塊面積的20%—30%。這些癌穴的結(jié)構(gòu)也不盡相同，依據(jù)與軟骨組織之間有無明顯的邊緣結(jié)構(gòu)，可初步劃分為2大類：有界膜結(jié)構(gòu)和無明顯界膜結(jié)構(gòu)，而這2種結(jié)構(gòu)還可依據(jù)形態(tài)劃分，以下分別敘述。

有界膜結(jié)構(gòu)的“癌穴”形態(tài)呈規(guī)則的圓形(圖2g)是最多見的類型，整體呈圓形，由界膜、外圈和核心3部分組成。“界膜”，由3—7層扁平細(xì)胞圍成，其間有浸潤的嗜酸性細(xì)胞；外圈，即靠近界膜的一個(gè)同心圓區(qū)域，由排列緊密而不規(guī)則細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞較構(gòu)成界膜的細(xì)胞明顯增大，越接近界膜處，細(xì)胞體積越大。而近核心處有較多的嗜酸性細(xì)胞存在。這些構(gòu)成外圈的細(xì)胞界限較模糊，胞質(zhì)弱嗜堿性，部分細(xì)胞胞質(zhì)呈水樣或脂肪變性。胞核較大淡染，染色質(zhì)有邊緣化分布的趨勢(shì)，少量細(xì)胞可見核仁。核心，即“角化珠”是一個(gè)圓形或橢圓形的強(qiáng)嗜酸性區(qū)域，無典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也非均質(zhì)。核心與外圈部分常呈分離狀。但個(gè)別“癌穴”的核心也有呈嗜堿性的區(qū)域，且多呈破損狀或嚴(yán)重破損狀。

有界膜結(jié)構(gòu)的“癌穴”形態(tài)呈不規(guī)則的橢圓形(圖2h)，較為少見，整體呈長梭型，界膜，中部分外側(cè)區(qū)域出現(xiàn)了較多的纖維成份、嗜酸性細(xì)胞以及呈索狀的藍(lán)紫色嗜堿性“鈣化線”。界膜內(nèi)部一端有大量小細(xì)胞充斥，細(xì)胞圓形，界限不清，胞質(zhì)弱嗜堿性，胞核大，染色質(zhì)大多邊緣化排列，核仁可見；另一端為圓形的一大一小癌穴外圈，癌穴核心或無或不典型，僅有少量的強(qiáng)嗜酸性物質(zhì)。

無界膜結(jié)構(gòu)的“癌穴”有角化珠的雛形(圖2i)，界膜缺失，僅有癌穴外圈結(jié)構(gòu)，在其中有散在的1—3個(gè)小型強(qiáng)嗜酸性斑塊，即不典型的角化珠。

無界膜結(jié)構(gòu)的“癌穴”衛(wèi)星城角化珠(圖2j)，界膜缺失，在癌穴邊緣區(qū)域出現(xiàn)少量的不連續(xù)的扁平細(xì)胞和纖維成分圍繞，癌穴的大部分僅由外圈成分構(gòu)成，在中心區(qū)域雖有強(qiáng)嗜酸性物質(zhì)累積，但仍以軟骨組織為主。癌穴的邊緣和近邊緣處均可見嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，并可見少量的細(xì)胞分裂相出現(xiàn)。

圖2 烏蘇里蝮腫塊HE染色結(jié)果Fig.2 The HE staining of tumors in Gloydius ussuriensis 注：a-f.腫瘤橫切；g.圓形有界膜癌穴；h.長梭形有界膜癌穴；i-j.無界膜癌穴；N.癌穴；CH.軟骨細(xì)胞；WCC.皺縮的軟骨細(xì)胞；L.淋巴細(xì)胞；CP.鈣化斑；DBV.變性血管；EG.嗜酸性顆粒細(xì)胞；LM.界膜 Note：a-f.Tumor crosscutting.g.Circular of nest with limitans membrane.h.Fusiform of nest with limitans membrane.i-j.Nest without limitans membrane.N.Nest.CH.Chondrocyte cell.WCC.Wizened chondrocyte cell.L.Lymphocyte.CP.Calcified plaque.DBV.Degenerative blood vessels.EG.Eosinophilic granulocyte.LM.Limitans membrane

2.3 血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

由表2可見，腫瘤蛇的紅細(xì)胞數(shù)和血紅蛋白含量雖然均低于正常蛇，兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05)。腫瘤蛇的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和中間細(xì)胞(主要指單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)均低于正常蛇，并均呈顯著性差異(P<0.05)。其中，腫瘤蛇的中性粒細(xì)胞僅為正常蛇的57.38%。值得注意的是，腫瘤蛇的血小板數(shù)量僅為正常蛇的21.05%，兩者之間呈極顯著性差異(P<0.01)。

2.4 血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

受檢的K、Na、Cl和Mg 4種血清無機(jī)鹽離子的含量，正常蛇和腫瘤蛇之間非常接近，均無顯著性差異(P>0.05)。但腫瘤蛇血清中鈣、磷含量均明顯低于正常蛇，分別是正常蛇的82.51%和78.42%，均無顯著性差異(P>0.05)，但鈣磷乘積腫瘤蛇與正常蛇之間呈顯著性差異(P<0.05)。堿性磷酸酶活性腫瘤蛇僅為正常蛇的46.1%，兩者之間呈極顯著性差異(P<0.01)(表3)。

表2 烏蘇里蝮血細(xì)胞參數(shù)Tab.2 Blood cell parameter of Gloydius ussuriensis

注：P≥0.05為不顯著，*0.01≤P<0.05為顯著，**P<0.01為極顯著
Note：P≥0.05 is not significant between data，0.01≤P<0.05 *show the data is significant different，P<0.01 **show the data is very significant

表3 烏蘇里蝮血清相關(guān)指標(biāo)Tab.3 Serum index of Gloydius ussuriensis

續(xù)表3

注：P≥0.05為不顯著，*0.01Note：P≥0.05 is not significant between data，0.01

血糖含量，腫瘤蛇是正常蛇的187.04%，兩者間呈顯著性差異(P<0.05)，但與其相關(guān)的糖化血清蛋白含量腫瘤蛇雖略高于正常蛇，但無顯著性差異(P>0.05)。

在血清中甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇含量，腫瘤蛇均低于正常蛇，僅總膽固醇含量腫瘤蛇與正常蛇之間呈極顯著性差異(P<0.01)，其他3項(xiàng)均無顯著性差異(P>0.05)。脂蛋白含量腫瘤蛇與正常蛇者間呈顯著性差異(P<0.05)。

總膽紅素含量腫瘤蛇略低于正常蛇，間接膽紅素含量腫瘤蛇略高于正常蛇，兩者指標(biāo)在腫瘤蛇與正常蛇之間無顯著性差異(P>0.05)。直接膽紅素含量腫瘤蛇高于正常蛇，兩者間極顯著性差異(P<0.05)。直接膽紅素與總膽紅素的比值腫瘤蛇是正常蛇239.2%。

心肌酶系包括a-羥丁酸脫氫酶、乳酸脫氫酶，肌酸激酶和肌酸激酶同工酶4項(xiàng)，這4種酶活性腫瘤蛇均高于正常蛇，其中僅a-羥丁酸脫氫酶活性在兩者間呈極顯著性差異(P<0.01)。 HBDH/LDH的比值腫瘤蛇高于正常蛇，兩者間呈顯著性差異(P<0.05)。

CA24-2(糖鏈抗原24-2)含量腫瘤蛇是正常蛇的216.14%，兩者間呈顯著性差異(P<0.05)；CA72-4(糖鏈抗原72-4)腫瘤蛇含量略低于正常蛇，兩者間無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 免疫組化

對(duì)S100、VIM、EMA和GFAP的免疫組織化學(xué)標(biāo)記結(jié)果顯示，S-100在腫瘤中的軟骨細(xì)胞中呈陽性，主要表達(dá)于胞質(zhì)及軟骨囊腔(圖3a)，但在無界膜的癌穴中有大量大小不一的強(qiáng)陽性細(xì)胞分布(圖3b)。VIM主要在腫瘤的邊緣區(qū)域的間質(zhì)細(xì)胞中呈陽性，尤其在角質(zhì)珠為強(qiáng)陽性(圖3c)，但在軟骨細(xì)胞為陰性(圖3d)。EMA在軟骨細(xì)胞質(zhì)膜為強(qiáng)陽性(圖3e)，在軟骨囊邊緣也有陽性表達(dá)。GFAP在癌穴的基質(zhì)呈陽性，但其中散在的軟骨細(xì)胞為陰性(圖3f)。在癌穴周邊的軟骨組織區(qū)域也有一些呈圓形或橢圓形的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性(圖3g)。

3 討論

3.1 腫瘤性質(zhì)的確定

對(duì)于爬行類腫瘤的研究主要來自對(duì)動(dòng)物園圈養(yǎng)類型的研究，學(xué)者指出在圈養(yǎng)情況下蛇類患上腫瘤的幾率要高于其他爬行類[1-2]。研究報(bào)道顯示，玉米蛇(Pantherophisguttatus)是軟骨肉瘤的易發(fā)者[5]。人類醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為軟骨肉瘤起源于胚胎時(shí)期軟骨遺跡或是多能間葉細(xì)胞參與了腫瘤發(fā)生[7]。病理檢測(cè)中將軟骨肉瘤劃分為普通型、透明細(xì)胞型、間葉型和去分化型四類。其中間葉型的惡性程度較高，且更易轉(zhuǎn)移[8]。間葉型軟骨肉瘤具有明顯的雙相分化特征，即由未分化原始間葉細(xì)胞和散在的島狀高分化的透明軟骨構(gòu)成。兩種成分的比例于不同病例中即或同一病例中的比例均有差異。兩種結(jié)構(gòu)或呈過渡態(tài)混合在一起，或兩者分界清楚。有的區(qū)域結(jié)構(gòu)稀疏有大小不等的空隙出現(xiàn)，也有局部呈現(xiàn)漸進(jìn)性腫瘤壞死。未分化細(xì)胞較小，呈圓形或梭形，排列緊密呈片狀分布，細(xì)胞核呈多態(tài)性，染色質(zhì)濃集深染，細(xì)胞質(zhì)少。細(xì)胞分裂相極少見[9]。軟骨區(qū)有典型的軟骨基質(zhì)及陷窩，軟骨細(xì)胞有輕度異型性，可有不規(guī)則點(diǎn)片狀鈣化灶[9-10]。在人類和其他哺乳動(dòng)物軟骨肉瘤的研究中，選取S-100和VIM進(jìn)行標(biāo)記。S-100蛋白是一種酸性鈣離子結(jié)合蛋白，主要分布在神經(jīng)組織中的各類細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞[11]。VIM，即波形蛋白。是一種中間纖維，負(fù)責(zé)細(xì)胞中細(xì)胞器的分配和定位。多種上皮源性的腫瘤均可表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的分化、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)[12]。對(duì)軟骨肉瘤進(jìn)行免疫組化觀察研究的結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞呈S-100蛋白陽性，未分化間葉瘤細(xì)胞呈VIM蛋白陽性[8-9，13-14]。本研究報(bào)道的烏蘇里蝮食道旁腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)特征和免疫組化的結(jié)構(gòu)均于上述相關(guān)特征一致，因此可以確認(rèn)進(jìn)行病理研究的這幾條烏蘇里蝮罹患了間葉型軟骨肉瘤。而EMA是上皮細(xì)胞胞膜上的糖蛋白，廣泛分布于各種上皮細(xì)胞和癌細(xì)胞[15]；GFAP是星型角質(zhì)細(xì)胞骨架蛋白的特有成分，它的表達(dá)與腦血管病、腫瘤及癲癇等多種疾病相關(guān)。也是神經(jīng)源性的組織細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)記物[16]。而EMA和GFAP在烏蘇里蝮的間葉型軟骨肉瘤中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了軟骨肉瘤具有上皮源性和神經(jīng)源性的雙重特點(diǎn)。

3.2 血栓細(xì)胞與腫瘤

大量研究顯示，腫瘤細(xì)胞能夠分泌含有RNA的外泌體，當(dāng)其被釋放進(jìn)入血液后就會(huì)被血小板吞噬，從而改變血小板中的RNA水平。而血小板中的RNA是調(diào)節(jié)血小板功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。更為重要的是在腫瘤環(huán)境中，血小板能夠通過釋放胞內(nèi)物質(zhì)促成腫瘤的惡性發(fā)展[17-18]。另外，血小板的數(shù)量的增加與結(jié)腸癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌等惡性腫瘤有著密切的關(guān)系[19]。然而，罹患間葉型軟骨肉瘤的烏蘇里蝮的血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，各類白細(xì)胞均低于正常蛇，兩者間均有顯著性差異(表2)。另外更加值得注意的是患病的烏蘇里蝮的血栓細(xì)胞的數(shù)量腫瘤蛇僅為正常蛇的22%，兩者間為極顯著性差異。這個(gè)數(shù)據(jù)與人類醫(yī)學(xué)研究的結(jié)果正好相反，是爬行類生理特征與人類之間的差異，還是其他因素導(dǎo)致，有待于積累病例深入研究。

3.3 血清指標(biāo)與腫瘤

在動(dòng)物疾病診斷中，堿性磷酸酶是反映骨改變?nèi)^程的重要指標(biāo)，特異性、準(zhǔn)確性和靈敏度均優(yōu)于其他指標(biāo)[20]。乳酸脫氫酶(LDH)同工酶中的羥丁酸脫氫酶(HBDH)與乳酸脫氫酶的比值(HBDH/LDH)有可能是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化早期的一個(gè)生化指標(biāo)[21]，同時(shí)HBDH/LDH比值的升高也提示了心肌組織遭受了嚴(yán)重的損傷，而且其比值越高受損程度越嚴(yán)重[22]。罹患間葉型軟骨肉瘤的烏蘇里蝮的堿性磷酸酶低于正常蛇的活動(dòng)，而HBDH/LDH的比值遠(yuǎn)高于正常蛇，這兩個(gè)生化指標(biāo)是否可以作為今后蛇病診斷的有意義的參數(shù)也是有待于進(jìn)一步探究的。