花鼠腦組織灌流固定方法的探究

毛劍杰 朱青青 陳 坤 周洪昌 錢(qián) 晶 潘永良

(湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖州，313000)

腦組織形態(tài)和免疫組化、熒光等實(shí)驗(yàn)應(yīng)用廣泛，良好的灌流固定效果是保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的重要前提[1]。一種好的灌流固定方法不僅能有效提高灌流效率，減少動(dòng)物痛苦和瀕死時(shí)間，避免病理假象，還能節(jié)約固定液，最重要的是能阻止機(jī)體死亡后體內(nèi)蛋白類(lèi)物質(zhì)急速變性，避免組織細(xì)胞在自身溶酶體酶的作用下溶解破壞，最大限度地保持組織細(xì)胞的活體狀態(tài)和抗原性[2-3]。在大鼠灌流中生理鹽水的溫度常為4℃或37℃[4-5]，以往研究尚未評(píng)價(jià)生理鹽水溫度對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)如免疫組化的效果，且未有研究探討主動(dòng)脈結(jié)扎對(duì)腦組織灌流效果的影響。由于小型嚙齒動(dòng)物體型小，繁殖快，廣泛應(yīng)用于各模型的建立[6-7]，本文旨在評(píng)估是否主動(dòng)脈結(jié)扎和不同生理鹽水溫度(4℃和37℃)對(duì)花鼠(Tamiassibiricus)腦組織在體心臟灌流固定術(shù)中應(yīng)用效果影響，探討出一套簡(jiǎn)單、成功率高且適用于多數(shù)小型嚙齒動(dòng)物的灌流固定方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

野生成年雄性花鼠24只，抓自黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)(128°53′—128°55′E，47°10′—47°14′N(xiāo))，體重95—110 g，單籠飼養(yǎng)，正常明暗周期中適應(yīng)性馴養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組，每組6只。第1組：結(jié)扎腹主動(dòng)脈，生理鹽水4℃；第2組：不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，生理鹽水4℃組；第3組：結(jié)扎腹主動(dòng)脈，生理鹽水37℃組；第4組：不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，生理鹽水37℃組。所有關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)程，并盡可能減少動(dòng)物的痛苦。

1.2 主要試劑與儀器

生理鹽水及多聚甲醛溶液(41533，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；EDTA抗原修復(fù)液(ZLI—9066，1∶50，北京中杉公司)；山羊抗DCX抗體溶液(SC—8066，1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)；生物素兔抗山羊二抗(BA—5000，1∶300，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)；Vector Elite ABC(PK—6100，Vector Laboratories，Inc.Burlingtone，CA，USA)；0.05%DAB(D8001，上海西格瑪奧德里奇公司，上海)；恒流蠕動(dòng)泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；Leica CM1850冰凍切片機(jī)(Leica，Heidelberg，DE)。

1.3 灌流固定

腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(8 mg/100 g體重)，麻醉后迅速打開(kāi)胸腔，充分暴露心臟，剪去心包組織(圖1A-C)。在心尖搏動(dòng)明顯的部位插入灌流針，經(jīng)左心室到達(dá)主動(dòng)脈升部(肉眼可見(jiàn))，剪開(kāi)右心耳。打開(kāi)恒流蠕動(dòng)泵(圖1E)，以13 mL/min的流速?gòu)闹鲃?dòng)脈升部灌注生理鹽水，直至右心耳流出透明清亮液體，記錄生理鹽水灌流所需的時(shí)間，用于計(jì)算其用量。再繼續(xù)用4%多聚甲醛(4℃)以13 mL/min的流速灌流30 min。打開(kāi)顱腔，取出腦組織(圖1F)，進(jìn)行硬度測(cè)試和顏色觀察后，置于多聚甲醛溶液中后固定2 h，最后保存至4℃30%蔗糖溶液中。

1.4 硬度測(cè)試和顏色觀察

將灌流好的腦組織取出，水平放置于平整桌面，用刻度尺垂直水平桌面，測(cè)量其高度。接著將印壓計(jì)通過(guò)壓頭作用于待測(cè)組織，通過(guò)檢測(cè)其同等力度下腦袋下陷后的垂直高度，利用前后兩次高度，做差比較即可。用印壓測(cè)試的方法測(cè)試其硬度(其中壓頭重1 649.634 N)，并觀察記錄各器官(大腦、肝臟、肺臟)灌流前后的顏色變化，其具體檢測(cè)步驟參照以往文獻(xiàn)[8]。

1.5 冰凍切片和DCX免疫組化

腦組織在蔗糖溶液中沉底后進(jìn)行冠狀切片，厚度為40 μm，分為6套。取其中一套進(jìn)行DCX漂片免疫組化染色，步驟參照文獻(xiàn)[9-10]，并做了適當(dāng)改進(jìn)。步驟簡(jiǎn)單描述如下，腦切片于EDTA抗原修復(fù)液90℃水浴孵育15 min，室溫放置25 min，0.05% H2O2中孵育30 min。之后在10%兔血清(含0.5%TritonX-100)封閉1 h后，切片在山羊抗DCX抗體溶液(1∶2 000)4℃孵育36 h，室溫2 h。生物素兔抗山羊二抗(1∶300)室溫孵育2 h，Vector Elite ABC中反應(yīng)90 min。最后，用0.05%DAB 和0.009%H2O2顯色。染色后的腦片貼于防脫載玻片上，晾干后經(jīng)梯度酒精(75%，95%，100%)各脫水5 min，二甲苯透明10 min，再用中性樹(shù)膠封片。為了降低染色過(guò)程中的變異性，所有染色同步進(jìn)行，待腦片風(fēng)干后在顯微鏡下觀察并拍照統(tǒng)計(jì)DCX陽(yáng)性的細(xì)胞的數(shù)量。

1.6 腦片量化

對(duì)應(yīng)大鼠腦圖譜[11]第29—32頁(yè)，在顯微鏡放大400倍條件下，量化兩側(cè)海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞并計(jì)算其密度。每個(gè)動(dòng)物選取4—5張切片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 圖片顯示花鼠灌流固定的一些主要步驟。打開(kāi)胸腔，暴露心臟和剝開(kāi)心包膜(A—C)，從左心室插入灌流針到主動(dòng)脈升部，剪開(kāi)右心耳和結(jié)扎腹主動(dòng)脈(D)，打開(kāi)蠕動(dòng)泵，用生理鹽水和4%多聚甲醛灌流固定(E)，取出腦組織(F)Fig.1 Photomicrographs displaying some of the main steps of perfusion and fixation for Siberian chipmunk.Open the chest，expose the heart and peel pericardium(A-C)，pass the perfusion needle through the left ventricle into the ascending aorta，cut the right atrium and ligature the abdominal aortas(D)，run the peristalsis pump，do the perfusion and fixation with normal saline and 4% paraformaldehyde(E)，remove the brain(F)

2 結(jié)果

2.1 生理鹽水用量

雙因素方差分析表明，是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈和不同生理鹽水的溫度(4℃ 和 37℃)對(duì)灌流時(shí)生理鹽水的用量都有顯著影響。結(jié)扎腹主動(dòng)脈組所需生理鹽水的用量明顯低于不結(jié)扎腹主動(dòng)脈組(F(1，21)=67.53，P<0.01)；而生理鹽水4℃組所需生理鹽水的用量明顯高于37℃組(F(1，21)=4.36，P<0.05)(圖2)。

圖2 是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈及不同溫度(4℃和37℃)對(duì)腦組織灌流時(shí)生理鹽水用量的影響。*表示達(dá)到P<0.05顯著的處理效應(yīng)，而希臘字母表示溫度差異。誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM) Fig.2 The effects of the ligation of the abdominal aortas and temperature(4 ℃ and 37 ℃)on the volume of normal saline.* Indicates significant treatment effects at P<0.05.While Greek letters indicate temperature differences.Error bars represent standard errors of the mean(SEM)

2.2 腦組織的硬度

雙因素方差分析表明，是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈(F(1，21)=0.77，P>0.05)和生理鹽水的溫度(4℃ 和 37℃)(F(1，21)=2.35，P>0.05)對(duì)腦組織硬度無(wú)顯著影響(圖3)。

圖3 是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈及不同溫度(4℃和37℃)對(duì)灌流后腦組織硬度的影響。誤差線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM) Fig.3 The effects of the ligation of the abdominal aortas and temperature(4 ℃ and 37 ℃)on the hardness of brain tissue.Error bars represent standard errors of the mean(SEM)

2.3 各組織器官灌流前后的顏色變化

4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的腦組織顏色在灌流后均為乳白色，肺臟顏色仍為淺紅色。不結(jié)扎腹主動(dòng)脈組肝臟的顏色則由原來(lái)的暗紅色明顯變白，而結(jié)扎腹主動(dòng)脈組肝臟顏色沒(méi)有發(fā)生明顯變化。在結(jié)扎或非結(jié)扎組，不同溫度的生理鹽水對(duì)各組織器官顏色的變化無(wú)明顯影響。

2.4 海馬DG區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞的密度

雙因素方差分析表明，是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈對(duì)DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度無(wú)顯著影響(F(1，21)=0.001，P>0.05)。生理鹽水溫度對(duì)海馬DG區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞的密度有顯著影響(F(1，21)=4.37，P<0.05)。生理鹽水4℃組的海馬DG區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度與37℃組相比顯著更高(圖4，圖5)。

圖4 是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈及溫度(4℃和37℃)對(duì)海馬DG區(qū)域被DCX標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞密度的影響。希臘字母表示溫度差異，誤差線(xiàn)代表標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM) Fig.4 The effects of the ligation of the abdominal aortas and temperature(4 ℃ and 37 ℃)on the density of DCX-labeled cells in the dentate gyrus DG of the hippocampus.Greek letters indicate temperature differences.Error bars represent standard errors of the mean(SEM)

圖5 4℃(A)或37℃(B)生理鹽水灌流后花鼠海馬DG區(qū)域的DCX陽(yáng)性染色示意圖(×100)。GCL：顆粒細(xì)胞層，MCL：分子層，Hilus：門(mén)區(qū) Fig.5 Composed photomicrographs displaying DCX staining in the dentate gyrus DG of the hippocampus in chipmunks perfused with 4℃(A)or 37℃(B)normal saline(×100).GCL：granular cell layer of the DG，MCL：molecular cell layer of the DG

3 討論

腦組織固定常用于腦形態(tài)學(xué)研究[12]。良好的組織固定是保持細(xì)胞形態(tài)完整和抗原性的關(guān)鍵，固定可防止組織細(xì)胞的自溶與腐敗，保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖等各種成分與生活時(shí)相仿[1]，腦組織耐氧能力差，對(duì)灌流固定條件較為嚴(yán)苛，條件不當(dāng)就難以完整地保留細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)[13]。由于各文獻(xiàn)報(bào)道的腦組織灌流固定條件有所出入，且目前尚無(wú)文章對(duì)不同條件下的固定效果做統(tǒng)一評(píng)價(jià)，如是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈和生理鹽水溫度，本文在此方面進(jìn)行了研究并試圖探討出一套適用于多數(shù)小型嚙齒動(dòng)物的灌流方法。

結(jié)扎腹主動(dòng)脈組灌流時(shí)所需的生理鹽水用量少于不結(jié)扎組，省時(shí)，省液，且腦組織硬度無(wú)明顯差異，提示相比單位時(shí)間里多聚甲醛流過(guò)腦組織的量，腦組織硬度可能與多聚甲醛固定時(shí)間更有關(guān)。不論是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈，腦組織顏色均由鮮紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫鶆虻娜榘咨捎诠嗔鞯难h(huán)路徑不經(jīng)過(guò)肺循環(huán)，因此肺臟均保持粉紅色。由于結(jié)扎了腹主動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)組在灌流時(shí)，液體只通過(guò)上腔靜脈途徑而不會(huì)經(jīng)過(guò)肝臟，因此結(jié)扎組的肝臟顏色沒(méi)有發(fā)生明顯變化，始終呈現(xiàn)暗紅色。而在沒(méi)有結(jié)扎的實(shí)驗(yàn)組中，灌流液會(huì)經(jīng)下腔靜脈途徑流經(jīng)肝臟，使肝臟從原來(lái)的暗紅色轉(zhuǎn)變成白色。免疫組織染色顯示，是否結(jié)扎腹主動(dòng)脈對(duì)DG區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞的密度沒(méi)有顯著影響，且腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元形態(tài)完整，印證了固定液對(duì)組織的作用時(shí)間可能比單位時(shí)間流經(jīng)組織的量，更為影響灌流固定的效果，上述結(jié)果說(shuō)明結(jié)扎主動(dòng)脈不會(huì)影響灌流固定后續(xù)的實(shí)驗(yàn)效果。

生理鹽水溫度為4℃時(shí)其用量顯著高于37℃時(shí)，這可能跟血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)溫度變化很敏感，較低的溫度會(huì)引起其收縮和損傷，導(dǎo)致血管壁的通透性增加[14]。因此，在當(dāng)前研究中，低溫(4℃)生理鹽水可能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而使部分用于清除血液的生理鹽水滲出到組織間隙，導(dǎo)致需要更多的生理鹽水清除體內(nèi)的血液。免疫組化結(jié)果顯示：生理鹽水4℃時(shí)，DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度明顯高于37℃，說(shuō)明灌流溫度對(duì)DCX陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)存在影響。打開(kāi)動(dòng)物胸腔后，大腦缺血缺氧，導(dǎo)致機(jī)體開(kāi)始死亡。以往的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧氣高度敏感，降低溫度可以減少腦組織氧耗并通過(guò)降低無(wú)氧代謝率來(lái)防止腦組織中乳酸堆積，因而可增加神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺氧缺血的耐受性從而延緩神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[15-16]。因此，低溫生理鹽水灌注可能延緩了機(jī)體死亡后因缺氧引起的DCX陽(yáng)性細(xì)胞的凋亡。

經(jīng)過(guò)此次實(shí)驗(yàn)探討，本文總結(jié)出了一套簡(jiǎn)單且適用于小型嚙齒動(dòng)物免疫組化的灌流方式，即采用左心室心尖入針到達(dá)主動(dòng)脈升部，在結(jié)扎腹主動(dòng)脈后，用4℃的生理鹽水快速清除體內(nèi)的血液，再用4℃的4%的多聚甲醛進(jìn)行灌流固定，該方法操作簡(jiǎn)單，省時(shí)、省液，有效提高灌流固定效果。

致謝：感謝湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院張孝利、聞佳穎、楊雨晨同學(xué)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程中的幫助。