發(fā)酵床微生物群落構(gòu)成及其對(duì)圈養(yǎng)綠狒狒的影響

潘麒嫣 朱迎娣 耿廣耀 徐艷春，3，4 王愛(ài)善* 黃 晶 楊淑慧*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.上海動(dòng)物園，上海，200335；3.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)物保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，哈爾濱，150040；4.國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物檢測(cè)中心，哈爾濱，150040)

目前，大多數(shù)動(dòng)物園靈長(zhǎng)類(lèi)的籠舍都使用水泥等硬質(zhì)地面，其優(yōu)點(diǎn)是方便清理、沖洗和消毒，也減少飼料的污染。但是，室內(nèi)供暖設(shè)施通常不在地面，而是設(shè)置在空中，冬季雖然室內(nèi)溫度能夠達(dá)到動(dòng)物的要求，地面溫度仍然很低。尤其是在清理或消毒時(shí)經(jīng)過(guò)用水沖洗，地面更加潮濕和寒冷。靈長(zhǎng)類(lèi)直接接觸地面，不可避免地遭受寒冷侵襲，甚至引起疾病。此外，這種地面也大大影響展示效果。

發(fā)酵床技術(shù)是一種利用復(fù)合菌劑就地轉(zhuǎn)化動(dòng)物排泄廢物的新型生態(tài)環(huán)保養(yǎng)殖技術(shù)，通過(guò)微生物的分解作用將動(dòng)物糞、尿降解，從而節(jié)省清理成本，并達(dá)到節(jié)水、節(jié)能，低污染低排放[1-2]。更重要的是，微生物發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一定的熱量[3]，在冬季有助于提高動(dòng)物福利[4]。因而廣泛應(yīng)用于生豬、牛以及禽類(lèi)養(yǎng)殖[5-6]。

為了改進(jìn)靈長(zhǎng)類(lèi)籠舍環(huán)境，我們?cè)谛笄蓊?lèi)發(fā)酵床技術(shù)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了靈長(zhǎng)類(lèi)發(fā)酵床，并在上海動(dòng)物園進(jìn)行了試驗(yàn)研究。發(fā)酵床以木屑、米糠和黃土作為基本墊料，采用發(fā)酵床微生物合劑進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵床群落達(dá)到頂極后作為山魈(Mandrillussphinx)籠舍的地面。行為監(jiān)測(cè)顯示，相比普通籠舍，從12月至翌年2月，山魈地坐息時(shí)間降低了約50%，且坐息行為大部分都發(fā)生在墊料上面?；钴S時(shí)間提高了近10倍，其中探究行為占49%，咀嚼行為占23%，大大降低了刻板行為的頻率[7]。

但是，微生物發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生氨、氧化亞氮、甲烷、二氧化硫等有害氣體[3]，細(xì)菌群落中也含有細(xì)菌毒素，在山魈實(shí)驗(yàn)中雖然未觀察到動(dòng)物健康下降的情況，但仍有可能對(duì)動(dòng)物健康造成不利影響。本研究采用這一發(fā)酵床技術(shù)，以綠狒狒(Papioanubis)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)發(fā)酵床不同深度細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，觀察細(xì)菌群落對(duì)動(dòng)物的安全性。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵床的制備

本研究于2018年于2月18日—3月20日在上海動(dòng)物園進(jìn)行。選定一間長(zhǎng)5.1 m、寬3.6 m、高 3.4 m長(zhǎng)方形室內(nèi)展區(qū)。發(fā)酵床基質(zhì)厚約75 cm，由木屑、米糠和黃土按質(zhì)量比5∶4∶1混合，用益加益發(fā)酵床專(zhuān)用菌種(益加益生物工程有限公司，鄭州)與墊料充分混合，墊料的濕度控制在50%左右(圖1)。發(fā)酵床專(zhuān)用菌種由乳桿菌屬(Lactobacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、放線菌屬(Actinomyces)、酵母菌屬(Saccharomyces)、光合細(xì)菌、絲狀真菌中的多種有益微生物菌群及其代謝產(chǎn)物復(fù)配而成。發(fā)酵床鋪設(shè)完畢后，在其表面鋪設(shè)一層塑料薄膜，發(fā)酵2 wk，待其微生物群落穩(wěn)定期后，移除地膜。24 h后把2只綠狒狒放入籠舍飼養(yǎng)和展出。該籠舍與其他籠舍一樣設(shè)有暖氣和豐容設(shè)施(主要是倒木)。日常管理僅對(duì)于飼料臺(tái)、玻璃等部分用少量水沖洗，移除糞便。每隔7 d把發(fā)酵床人工翻動(dòng)一次。籠舍內(nèi)和籠舍外的參觀通道均設(shè)置溫度計(jì)和濕度計(jì)，定時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵床的含水量，適時(shí)補(bǔ)充水分，使之保持較為穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖1 發(fā)酵床結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of fermentation bed

1.2 溫度的監(jiān)測(cè)

發(fā)酵床溫度穩(wěn)定后，自2月18日—3月20日期間，每日12：00對(duì)發(fā)酵床籠舍的墊料中層(25 cm處)、籠舍內(nèi)的溫度(距地面2.0 m)和籠舍外參觀通道的溫度進(jìn)行記錄。

1.3 發(fā)酵床不同深度的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在發(fā)酵床中心點(diǎn)以及該點(diǎn)到四角距離的1/2處各選取1個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)分別在表面(0 cm)、25 cm、50 cm和75 cm深度各挖取墊料樣本約200 g，將5個(gè)采樣點(diǎn)同一深度的樣品等量混合均勻，然后分成3份，作為該深度的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共得到12份樣品。所有樣品都采用1.5倍體積的DET保存液(含有0.25 mol/L的EDTA、20%的DMSO、0.1mol/L的Tris(pH 7.5)和飽和的NaCl)常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

在無(wú)菌條件下采用CTAB法分別提取各墊料樣本的總DNA，于-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。采用原核生?6S rDNA V4區(qū)的通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)各墊料樣本的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(30 μL)包括2×Phusion Master Mix 15 μL、Primer(2 μmol/L)3 μL、總DNA(1 ng/μL)10 μL、去離子水2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s、50℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific，美國(guó))純化回收。用TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫(kù)試劑盒(Illumina，美國(guó))進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，用HiSeq 2000(Illumina，美國(guó))平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

用Cutadapt軟件將經(jīng)過(guò)16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，并按barcode拆分樣本，切除barcode 和引物序列后，使用FLASH軟件進(jìn)行序列拼接，對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，去除其中的嵌合體序列得到最終的有效數(shù)據(jù)，然后用Uparse 軟件在97%的相似性閾值下，將剩余的序列聚類(lèi)為操作分類(lèi)單元(OTU)，并對(duì)OTUs進(jìn)行物種注釋?zhuān)肕othur軟件計(jì)算常用的生物多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 溫度變化與動(dòng)物行為

監(jiān)測(cè)期間，發(fā)酵床中層溫度、籠舍溫度和參觀通道溫度的變化如圖2所示。參觀通道相對(duì)開(kāi)放，因此，此處的溫度受到天氣溫度的影響比較明顯，2月中旬到3月中旬保持在4.6℃—11.8℃，略有波動(dòng)。到3月15—19日出現(xiàn)一次升溫，20日又回落到正常水平。籠舍內(nèi)的溫度也受到天氣升溫的影響，但總體上比參觀通道高1℃—7.9℃。發(fā)酵床中層的溫度沒(méi)有受到室溫和天氣的影響。制備初期，籠舍溫度低于10℃的情況下，發(fā)酵床的溫度達(dá)到20℃—25℃，隨著發(fā)酵程度的加深，溫度在3 d之內(nèi)就升到最高峰45℃，隨后緩慢回落，到3月中旬達(dá)到穩(wěn)定期，處于28℃—30℃。雖然外界氣溫和籠舍的溫度有所變化，但發(fā)酵床的溫度保持穩(wěn)定，為綠狒狒提供溫暖的地面環(huán)境。

監(jiān)測(cè)期間，綠狒狒未觀察到臨床上的不良狀態(tài)。采用發(fā)酵床之前綠狒狒大部分時(shí)間都擠在取暖設(shè)備附近。采用發(fā)酵床后，綠狒狒大部分時(shí)間都在發(fā)酵床上活動(dòng)，主要是翻動(dòng)發(fā)酵床尋找里面滋生的各種甲蟲(chóng)和蠕蟲(chóng)，并放到口中咀嚼。綠狒狒可將發(fā)酵床翻動(dòng)至25 cm深度，有機(jī)會(huì)接觸從表面到這一深度的各類(lèi)微生物，并通過(guò)采食甲蟲(chóng)等，將發(fā)酵床微生物與腸道微生物建立聯(lián)系。

圖2 2月下旬至3月中旬發(fā)酵床中層(深25 cm處)、籠舍和參觀通道的溫度波動(dòng)Fig.2 Temperature dynamics of fermentation substrate middle layer(at 25 cm in depth)，enclosure and visitor passageway

2.2 發(fā)酵床不同深度的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 OTU聚類(lèi)分析

經(jīng)過(guò)16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序，獲得999 077條原始序列數(shù)據(jù)。根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接和質(zhì)控過(guò)濾，共得到956 205個(gè)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的序列。稀釋曲線(rarefaction curve)顯示，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到40 000 reads以上時(shí)，OTU數(shù)趨于穩(wěn)定，表明測(cè)序深度已經(jīng)足夠覆蓋樣品中所有的細(xì)菌物種。在12個(gè)樣本中，共確定3 564個(gè)真細(xì)菌和古菌操作分類(lèi)單元(OTU)。S0、S25、S50、S75各層分別有2 644、2 217、2 270和2 189個(gè)OTU。

2.2.2 門(mén)水平上細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

以上OTU數(shù)據(jù)從4個(gè)不同深度的發(fā)酵床樣品中共確定41個(gè)門(mén)的細(xì)菌，占總OTU數(shù)的98.26%。圖3顯示相對(duì)豐度排序前28的門(mén)，其中相對(duì)豐度最高的為變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，占總相對(duì)豐度的94.73%。

這4個(gè)門(mén)在發(fā)酵床不同深度的樣品中相對(duì)豐度存在明顯的差異。如圖3所示，發(fā)酵床表層(S0組)共注釋到34個(gè)門(mén)，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為37.01%、27.34%、19.33%和9.94%；25 cm處(S25組)共注釋到30個(gè)門(mén)，放線菌門(mén)優(yōu)勢(shì)最為明顯，相對(duì)豐度占55.31%，而厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度分別為16.64%、16.37%和10.50%。50 cm處(S50組)共注釋到31個(gè)門(mén)，以變形菌門(mén)和放線菌門(mén)為主，相對(duì)豐度分別為38.89%和33.45%，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別為 18.46%和5.22%；相比S0而言，放線菌門(mén)的相對(duì)豐度有所增加，而厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度有所下降；75 cm處(S75組)處于發(fā)酵床的最底層，共注釋到37個(gè)門(mén)，變形菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度達(dá)到64.48%，而放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)都明顯減小，分別為 10.80%、8.81%和5.35%?？傮w上看，S25、S50、S75組表現(xiàn)出隨著深度的增加，變形菌門(mén)相對(duì)豐度逐漸增加，而放線菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度逐漸降低的趨勢(shì)，但S0組的群落結(jié)構(gòu)不符合這一規(guī)律，說(shuō)明S0組細(xì)菌的生境與其他深度有明顯的異質(zhì)性。

2.2.3 屬水平上細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

4組不同深度的發(fā)酵床樣品中共確定574個(gè)屬，占總OTU數(shù)的97.29%。圖4顯示相對(duì)豐度排序前28的屬，其中優(yōu)勢(shì)屬主要包括Glutamicibacter、解木聚糖微菌屬Xylanimicrobium、藤黃色桿菌屬(Luteibacter)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、Arachidicoccus、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、芽孢桿菌屬、德沃斯氏菌屬(Devosia)和Taibaiella等11個(gè)屬，總相對(duì)豐度占所有屬分類(lèi)水平的64.86%。

不同深度發(fā)酵床樣品中屬水平細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異：S0組中Glutamicibacter占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度占24.24%；S25組糖多孢菌屬占有優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度占16.91%，鏈霉菌屬和葡萄球菌屬相對(duì)豐度也較高，分別為10.40%和7.52%；S50組中Xylanimicrobium占有優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度占S50組的17.46%，其次為Arachidicoccus屬，相對(duì)豐度為10.02%；S75組中除藤黃色桿菌屬相對(duì)豐度較高外，占到S75組的13.94%，德沃斯氏菌屬相對(duì)豐度也較高，為6.68%。

觀察發(fā)現(xiàn)，綠狒狒經(jīng)常翻動(dòng)發(fā)酵床，但是翻動(dòng)深度在0—25 cm范圍內(nèi)。因此，把S0和S25兩個(gè)深度的樣品合并分析。結(jié)果顯示，S0組和S25組總相對(duì)豐度超過(guò)1%的屬共17個(gè)，排在前5位的有Glutamicibacter、糖多孢菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬，占到總相對(duì)豐度的34.31%。其中主要以有益菌為主的屬有13個(gè)，總相對(duì)豐度為42.26%；以致病菌為主的屬有4個(gè)，總相對(duì)豐度為11.08%。兩組合并后，總相對(duì)豐度超過(guò)1%的屬有17個(gè)，占總相對(duì)豐度的53.54%(圖5)。

圖3 發(fā)酵床不同深度的細(xì)菌在門(mén)水平上的群落組成Fig.3 Variation of bacterial community composition of the fermentation substrate among different depths at phylum levelS0：表層；S25：25 cm深處；S50：50 cm深處；S75：75 cm深處S0：surface layer of the fermentation substrate.S25：25 cm in depth.S50：50 cm in depth.S75：75 cm in depth

圖4 發(fā)酵床不同深度的細(xì)菌在屬水平上的群落組成Fig.4 Variation of bacterial community composition of the fermentation substrate among different depths at genus levelS0：表層；S25：25 cm深處；S50：50 cm深處；S75：75 cm深處S0：surface layer of the fermentation substrate.S25：25 cm in depth.S50：50 cm in depth.S75：75 cm in depth

圖5 發(fā)酵床表層(S0)和25 cm深處(S25)屬水平上有益菌和致病菌及其相對(duì)豐度Fig.5 Genus and their relative abundance of probiotics and pathogenic bacteria of the surface layer(S0)and middle layer(S25)of the fermentation substrate

2.2.4 種水平上細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

鑒定到種的OTU僅占總數(shù)的23.70%。在種水平上，4組不同深度的發(fā)酵床墊料共注釋出具有明確分類(lèi)的種318個(gè)，其中注釋到9種總相對(duì)豐度超過(guò)1%的細(xì)菌，總相對(duì)豐度為72.23%，包括阿氏節(jié)桿菌(Glutamicibacterarilaitensis，異名Arthrobacterarilaitensis)、干草小多孢菌(Saccharopolysporarectivirgula，異名Micropolysporafaeni)、阿克曼粘細(xì)菌(Akkermansiamuciniphila)、洛菲不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)、普氏菌(Prevotellacopri)、格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri，或稱(chēng)加氏乳桿菌)、艱難梭菌(Clostridioidesdifficile)、Brevibacteriumepidermidis和羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)(圖6)。

S0組樣品中，阿氏節(jié)桿菌是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為58.57%，洛菲不動(dòng)桿菌、格氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌相對(duì)豐度也較高，分別為5.8%、2.66%和2.25%；S25組樣品中，干草小多孢菌是優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為35.58%，阿氏節(jié)桿菌和普氏菌相對(duì)豐度也較高，分別為7.21%和6.40%；S50組樣品中，僅阿氏節(jié)桿菌相對(duì)豐度較大，為8.59%；S75組樣品中，阿克曼粘細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌，相對(duì)豐度為17.11%，艱難梭菌相對(duì)豐度也較高，為6.43%。

在種的水平上，S0組和S25組共注釋到10種總相對(duì)豐度超過(guò)1%的細(xì)菌，其中有益菌占7種，分別是阿氏節(jié)桿菌、Brevibacteriumepidermidis、格氏乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、Lysobacterpocheonensis、Sporosarcinaaquimarina和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)，總相對(duì)豐度為46.78%；潛在致病菌3種，分別是干草小多孢菌、洛菲不動(dòng)桿菌和普氏菌，總相對(duì)豐度為22.10%(圖7)。

2.3 細(xì)菌群落多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性

OTU數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，每一樣品測(cè)序的覆蓋率均達(dá)到0.996，表明測(cè)序中未被測(cè)到的物種的概率極低，結(jié)果能夠反應(yīng)樣品的實(shí)際情況。S0、S25、S50、S75各層分別有2 644、2 217、2 270和2 189個(gè)OTU。4層共享OTU的數(shù)量為1 177個(gè)，按照深度順序，各層特有的OTU分別為300、206、197和181個(gè)，說(shuō)明各個(gè)深度為細(xì)菌提供的環(huán)境有著顯著差異。為了分析每個(gè)樣品細(xì)菌群落的多樣性，對(duì)每一深度的樣品計(jì)算了4種Alpha多樣性指數(shù)：ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)。表1顯示，4組樣品中S0的ACE指數(shù)(2 133.695)明顯高于其他3組(1 652.088—1 791.101)，說(shuō)明S0組的OTU數(shù)量，即物種數(shù)量最多。同時(shí)，S0組的Chao1指數(shù)(2 125.844)顯著高于其他3組(1 638.753—1 771.731)，表明該組物種的理論豐富度也是最高的。4組樣品的Simpson指數(shù)均為0.973—0.987，較為接近，說(shuō)明各組物種數(shù)量差異不很大，但是Shannon指數(shù)在S0組(8.144)明顯大于其他3個(gè)深度的樣品(7.205—7.814)，說(shuō)明發(fā)酵床表層物種的均勻度較高。另外，處于發(fā)酵床中下層的S50樣品無(wú)論是物種數(shù)量還是均勻度都稍微高于中上層的S25和底層的S75，再次印證發(fā)酵床內(nèi)部不同深度細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境差異較大。

圖6 發(fā)酵床不同深度的細(xì)菌在種水平上的群落組成Fig.6 Variation of bacterial community composition of the fermentation substrate among different depths at species levelS0：表層；S25：25 cm深處；S50：50 cm深處；S75：75 cm深處S0：surface layer of the fermentation substrate.S25：25 cm in depth.S50：50 cm in depth.S75：75 cm in depth

圖7 發(fā)酵床表層(S0)和25cm深處(S25)種水平上有益菌和致病菌及其相對(duì)豐度Fig.7 Species and their relative abundance of probiotics and pathogenic bacteria of the surface layer(S0)and middle layer(S25)of the fermentation substrate

表1 各組樣品細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 Indices of bacterial diversity for all samples in each group

2.3.2 Beta多樣性分析

主成分分析(PCA，principal component analysis)顯示，在諸多因素中，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是影響4組12個(gè)樣品之間差異性的主要因素，貢獻(xiàn)率分別為22.2%和16.67%。每個(gè)深度3個(gè)發(fā)酵床樣本分布在相同象限，且較為集中，表明各個(gè)重復(fù)之間的差異較小，每個(gè)深度細(xì)菌群落特征是可靠的。圖7顯示，S25和S50的群落組成較為相似，二者與發(fā)酵床底層S75和表層S0的差異性十分顯著。同時(shí)，S0與S75的差異也非常顯著。

圖8 各組樣品細(xì)菌Beta多樣性的PCA分析Fig.8 PCA analysis of beta diversity of samples in each groupS0：表層；S25：25 cm深處；S50：50 cm深處；S75：75 cm深處S0：surface layer of the fermentation substrate.S25：25 cm in depth.S50：50 cm in depth.S75：75 cm in depth

3 討論

發(fā)酵床養(yǎng)殖模式旨在通過(guò)益生菌繁殖的占位優(yōu)勢(shì)來(lái)抑制病原菌的繁殖和傳播，利用益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的升溫提高籠舍的地面溫度，并使養(yǎng)殖動(dòng)物在發(fā)酵床上健康成長(zhǎng)[8]。這3個(gè)目的在綠狒狒展館的發(fā)酵床測(cè)試中都達(dá)到了。

首先，參觀通道與外界直接相通，籠舍也有通風(fēng)窗口，受外界氣溫的影響較大。監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，籠舍內(nèi)的溫度比參觀通道溫度略高，并且波動(dòng)規(guī)律一致(圖2)。但是，發(fā)酵床中層溫度比籠舍室溫高很多，當(dāng)發(fā)酵床進(jìn)入發(fā)酵期時(shí)，籠舍溫度低于10℃，發(fā)酵床的溫度在20℃左右，經(jīng)歷迅速升溫階段后，達(dá)到頂峰溫度45℃，隨后緩慢回落，到達(dá)穩(wěn)定期后，維持在28℃—30℃，這在一定程度上有助于保持籠舍溫度。

更為重要的是，發(fā)酵床保持在28℃—30℃的水平上，綠狒狒每天大部分時(shí)間在發(fā)酵床上，翻動(dòng)至25 cm深，始終接受發(fā)酵床的熱量。相比普通的水泥硬質(zhì)地面，動(dòng)物福利有明顯的提高。

第二，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析顯示，S0組的OTU數(shù)量、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)都高于其他3組，即發(fā)酵床表層的細(xì)菌種類(lèi)和均勻度都高于其他3個(gè)深度(表1)，說(shuō)明此層組成群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜。在發(fā)酵床內(nèi)部，S50組樣品無(wú)論是物種數(shù)量還是均勻度都稍微高于S25和S75組(表1)，但差異不如S0與這3組間的差異大。Beta多樣性分析也顯示，S25和S50組的群落組成較為相似，二者與S75和S0組也各存在顯著差異，說(shuō)明發(fā)酵床內(nèi)部不同深度細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境差異較大。

綠狒狒對(duì)發(fā)酵床上的利用是以挖掘、翻找、采食里面滋生的小蟲(chóng)為主，挖掘深度一般不超過(guò)25 cm。因此，基本上處于S0到S25的微生物群落中。所接觸的微生物種類(lèi)相當(dāng)于二者的總和。文獻(xiàn)表明，S0和S25在屬水平上，以有益菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，總相對(duì)豐度為42.26%；潛在致病菌為主的屬僅有4個(gè)，總相對(duì)豐度為11.08%(圖5)。在種水平上相對(duì)豐度超過(guò)1%的細(xì)菌共有10種，其中氨氮降解細(xì)菌阿氏節(jié)桿菌占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，可有效去除銨態(tài)氮，減少了臭氣產(chǎn)生與擴(kuò)散，保障了籠舍周?chē)目諝赓|(zhì)量[9]，其他有益菌對(duì)腸道環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用[9-12]。有益菌總相對(duì)豐度占46.78%，處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。

潛在的致病菌是對(duì)動(dòng)物的主要威脅。在綠狒狒可接觸到的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)潛在致病菌的相對(duì)豐度占22.10%。其中優(yōu)勢(shì)菌干草小多孢菌的豐度達(dá)到14.60%.該菌是外源性過(guò)敏性肺泡炎(EAA)的病原體之一[13-15]。還有干草小多孢菌、洛菲不動(dòng)桿菌和普氏菌，主要導(dǎo)致肺炎、免疫力低下和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[16-17]。研究顯示，發(fā)酵床在發(fā)酵期間，內(nèi)部溫度升至45℃以上時(shí)，多數(shù)病原菌如大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門(mén)氏桿菌(Salmonellaspp.)等能被殺死[18]，而上述細(xì)菌是群落演替到穩(wěn)定期后檢測(cè)到的，是動(dòng)物可接觸的常在菌。但是，這些潛在致病菌僅在宿主遭受免疫和生理壓力，微生態(tài)平衡被打破而過(guò)度繁殖才會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物患病[19-20]。因此健康動(dòng)物攜帶的潛在致病菌常維持在較低水平。在試驗(yàn)期間，綠狒狒始終表現(xiàn)正常，從行為、消化機(jī)能(基于糞便的判斷)、精神狀態(tài)等表觀方面未發(fā)現(xiàn)任何患病跡象。因此，總體上說(shuō)，發(fā)酵床的微生物群落對(duì)綠狒狒是安全的。

最后，本實(shí)驗(yàn)選在上海動(dòng)物園，該地區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)性氣候，實(shí)驗(yàn)期間天氣較為溫暖，外部游客通道的溫度為4.6℃—17.1℃，平均9.2℃。動(dòng)物改變了以往擠在取暖設(shè)備附近的行為，轉(zhuǎn)而利用地面，且活動(dòng)量也大大增加。如果在最冷的1月(日均最高氣溫5℃，最低氣溫-5℃，https：//www.tianqi.com/qiwen/city-shanghai-winter/)，較之傳統(tǒng)的硬質(zhì)地面，發(fā)酵床會(huì)給動(dòng)物帶來(lái)更好的福利。