一例仔豬豬瘟病毒與大腸桿菌混合感染的調(diào)查分析

莫添麟 韋志文 韋成威 李 軍 賀會(huì)利 潘 艷*

（1.廣西河池市水產(chǎn)畜牧產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，廣西河池 547000；2.廣西河池市金城江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西河池 547000；3.廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

豬瘟，又稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性敗血性和高度接觸性傳染病。具有高度傳染病和致死性，豬是本病的唯一宿主。豬瘟病毒（Hogcholera virus，Swine fever virus）是ssRNA病毒，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm，核衣殼是立體對稱二十面體，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。豬瘟是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定通報(bào)的疫病，也是我國自 2007 年以來一直實(shí)行強(qiáng)制免疫的一類傳染病。豬瘟疫苗屬于國家強(qiáng)制性免疫疫苗，豬瘟疫苗免疫在我國普及率非常高。然而，當(dāng)前豬瘟在許多地方均有發(fā)生，嚴(yán)重危害養(yǎng)殖戶的利益。

大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，無芽孢。是動(dòng)物體內(nèi)重要的腸道菌群，大多不致病，屬于條件性致病菌。某些血清型菌株的致病性強(qiáng)，引起腹瀉，統(tǒng)稱致病性大腸桿菌。致病性大腸桿菌是一種重要的人獸共患病原菌，其血清型復(fù)雜。豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的以腹瀉為主的仔豬腸道傳染病，依據(jù)發(fā)病仔豬的臨床癥狀、病理剖檢變化以及流行病學(xué)，將該病分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病等。仔豬發(fā)病后發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，并導(dǎo)致脫水，敗血癥或繼發(fā)其他疾病，仔豬發(fā)育受阻，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料

1.1 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA Synthesis Kit、Taq MasterMix、DL 1500 DNA Marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠購自西班牙GENE公司。血平板培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 樣品來源

樣品來源于2018年廣西地區(qū)某規(guī)?；l(fā)病豬的肺臟、脾臟和小腸等病料樣品。

1.3 陽性對照

豬瘟病毒陽性疫苗保存于廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室由本實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 臨床癥狀及剖檢變化

病豬精神沉郁，體溫升高到40～42℃，持久不退。食欲減退或停食，行走四肢無力，行動(dòng)遲緩，搖擺不穩(wěn)，先便秘，后腹瀉。對病死豬剖檢可見，出血性淋巴結(jié)炎，淋巴結(jié)腫大，脾臟有邊緣性梗死，腎臟有大量出血點(diǎn)，肺臟呈局灶性出血斑，小腸系膜和胃漿膜有點(diǎn)狀出血；胃底粘膜潰瘍；胃腸粘膜呈現(xiàn)卡他性、出血性炎癥變化。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查

整個(gè)操作需無菌進(jìn)行，用接種環(huán)取肺臟、脾臟和小腸樣品，采用平板劃線法，接種在血瓊脂培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)18-24h后觀察，并進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察及鑒定。

2.3 藥敏試驗(yàn)

采用NCCLS推薦的K-B紙片法，選用青霉素類、頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類等10類共16種常用抗菌藥物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑（Ф），按照：Ф≥20 mm為敏感，15 mm≤Ф＜20 mm為中介，Ф＜15 mm為耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果。

2.4 PCR方法檢測

2.4.1 組織樣品RNA/DNA提取 將病死豬脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等病料樣品放入研磨器中混合研磨，加入1.5 ml滅菌生理鹽水，收集于2.0 ml的EP管中，-70℃反復(fù)凍融3次，8000 r/min離心5 min，取上清液置于另一滅菌的1.5 ml離心管中，12000 r/min離心15min，取上清液，按病毒DNA/RNA提取試劑盒說明進(jìn)行組織樣品RNA/DNA提取。按照HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。提取的病毒核酸-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 引物設(shè)計(jì) 參照羅廷榮等（2004）方法進(jìn)行CSFV檢測。CSFV檢測引物為CSFV-F：（5'-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3'）和CSFV- R：（5'-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3'），擴(kuò)增長度為508bp。引物由廣州華大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR檢測方法 CSFV的反應(yīng)體系為：2×Es Taq MasterMix 13 μl，上游引物、下游引物各1μl，DNA模板3 μl，ddH2O 7μl，總反應(yīng)體系 25 μl。瞬時(shí)離心混勻，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸10 min。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的分離鑒定

無菌采取送檢病料的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟樣品于血瓊脂培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)后，在淋巴結(jié)和脾臟均分離到細(xì)菌。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢（如圖1），可看到革蘭氏陰性桿菌。進(jìn)行生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此病原菌可以發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，MR試驗(yàn)陽性。VP試驗(yàn)陰性，動(dòng)力試驗(yàn)陽性，吲哚試驗(yàn)陽性，不利用枸櫞酸鹽，也不產(chǎn)生H2S氣體。經(jīng)過以上鑒定，可以確定該分離菌為大腸桿菌。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到的大腸桿菌對呋喃唑酮、痢菌凈高度敏感，對頭孢曲松鈉、頭孢拉定、頭孢氨芐、多粘菌素、磷霉素中毒敏感，對阿米卡星、壯觀霉素、卡那霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方恩諾明、強(qiáng)力霉素、安普霉素耐藥。

3.3 豬瘟病毒的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用RT-PCR的方法對病料樣品和陽性樣品進(jìn)行檢測，陽性樣品的片段大小在508bp，鑒定表明該病料中CSFV為陽性（圖2）。

圖2 CSFV的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

4 防治治療

及時(shí)隔離治療發(fā)病豬，對病死豬和無治療價(jià)值的豬采取無害化處理，防止病原擴(kuò)散。對被污染的圈舍、場地和飼具進(jìn)行嚴(yán)格徹底的消毒。加強(qiáng)豬場衛(wèi)生管理，加強(qiáng)免疫，調(diào)整免疫程序，給病豬肌肉注射呋喃唑酮，口服痢菌凈，飲水中添加檸檬酸 + 口服補(bǔ)液鹽連用 1周。

5 小結(jié)與討論

通過實(shí)驗(yàn)室檢測、臨床癥狀、剖檢分析，結(jié)果確診該病豬是由于豬瘟病毒和大腸桿菌混合感染。豬瘟是一種豬的急性接觸性傳染病，在我國各省都有發(fā)生，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，目前的防治措施是免疫接種，中國的豬瘟兔化弱毒疫苗免疫期可達(dá)一年以上，已被公認(rèn)為一種安全性良好、免疫原性優(yōu)越、遺傳性穩(wěn)定的弱毒疫苗。另外，開展免疫監(jiān)測，及時(shí)淘汰隱性感染帶毒種豬，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出，做好隔離、衛(wèi)生、消毒和殺蟲工作，可減少豬瘟病毒的侵入。大腸桿菌作為一種條件致病菌，血清型復(fù)雜，常在仔豬免疫功能降低時(shí)并發(fā)感染。規(guī)?；B(yǎng)豬場抗生素使用的不規(guī)范導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性較為嚴(yán)重，治療上應(yīng)采取中藥為主、抗生素為輔的方法防治，從而減少豬場的損失。