實時熒光PCR檢測非洲豬瘟病毒

李玫毅

（鄭州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南鄭州 450000）

0 引言

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒引起的豬的急性烈性傳染病。其臨陣癥狀從急性、亞急性到慢性不等，以高熱、皮膚發(fā)紺、全身內(nèi)臟器官廣泛出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征，發(fā)病率和死亡率幾乎高達100%。屬于世界動物衛(wèi)生組織（OIE）要求報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

非洲豬瘟自8月份在我國出現(xiàn)以來，國務院、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等先后出臺多套防控非洲豬瘟的文件和措施。2018年12月27日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了119號公告，要求在非洲豬瘟防控期間生豬屠宰廠（場）應當在駐場官方獸醫(yī)組織監(jiān)督下，按照生豬不同來源實施分批屠宰，每批生豬屠宰后，對暫儲血液進行抽樣并檢測非洲豬瘟病毒。經(jīng)PCR檢測試劑盒或免疫學檢測試紙條檢測為陰性的，同批生豬產(chǎn)品方可上市銷售。這一措施能有效避免非洲豬瘟病毒流入市場，降低病毒擴散的風險，保證百姓吃上放心肉。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

樣品來源于某屠宰場待宰生豬，其1860頭生豬均來自不同規(guī)模養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶，按照生豬不同來源實施分批屠宰，每批生豬≤100頭的，取一個混合血樣，每批生豬＞100頭的，每100頭取一個混合血樣，不足100頭的取樣時按一個混合血樣計。本實驗抽取的混合血樣樣品共計32份。

1.1.2 檢測儀器及試劑

PCR儀：購自西安天隆科技有限公司。

全自動核酸提取純化儀，核酸提取試劑盒：均購自杭州博日科技有限公司。

非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，批號：19010401，購自鄭州中道生物技術有限公司。

1.2 檢測方法

參照非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果判定

2.1 結(jié)果有效性

2.1.1 基線和閾值設定

基線調(diào)整取6—15個循環(huán)的熒光信號，閾值設定以閾值線剛好超過陰性對照檢測熒光曲線的最高點為原則。

2.1.2 質(zhì)量控制

反應結(jié)束后，陰性對照的檢測結(jié)果無特定的擴增曲線，Ct值為＞38或無；陽性對照的Ct值應≤30.0，且明顯的擴增曲線。

2.1.3 樣品判定

待檢樣品熒光信號有指數(shù)型增加，且結(jié)果顯示Ct值＜35.0，報告為陽性；未檢測到Ct值或Ct值＞38或無明顯擴增曲線，則樣品判定為陰性。35≤Ct≤38時，復檢一次，重復結(jié)果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。

2.2 結(jié)果

所有樣本的Ct值均為“無”，結(jié)果表明實驗中所有被測樣品均為ASFV抗原陰性。檢測結(jié)果見圖1。

圖1 檢測結(jié)果

3 討論

對于非洲豬瘟，世界范圍內(nèi)尚未研制出有效疫苗。在非免疫狀態(tài)下，使用實時熒光PCR進行非洲豬瘟病毒檢測，是目前靈敏度及準確度最高的方法。本實驗按照某屠宰場生豬不同來源實施分批，選取32份待宰生豬混合血液樣品進行檢測，未發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟陽性的病例。由于目前還沒有一個統(tǒng)一的生豬屠宰廠樣品采集和檢測方面有關的要求，也沒有出臺規(guī)范采樣、檢測和記錄等措施。所以本實驗是依據(jù)某屠宰場的實驗室情況制定的實驗標準，供大家參考。

由于非洲豬瘟發(fā)病有一定的潛伏期，如果在潛伏期內(nèi)生豬不發(fā)病，也沒有異常癥狀，但仍可能攜帶病毒，這種帶有病毒的生豬也會被出具“有效”的動物檢疫合格證明，進入到調(diào)運環(huán)節(jié)被屠企收購。而作為豬肉產(chǎn)品流通的重要守門者之一，屠企是有義務和責任展開相關檢測工作，扼守住非洲豬瘟的最后一道防線的。

未來各相關部門須繼續(xù)關注我國非洲豬瘟疫情發(fā)展態(tài)勢，根據(jù)防控形勢變化針對性地加強防控檢測，針對技術需求，展開聯(lián)合攻關，堅決打好打贏非洲豬瘟疫病防控戰(zhàn)。