殺菌劑和肥料對連作草莓根際土壤微生物多樣性的影響

陳 哲，黃 靜，趙 佳，梁 宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031）

連作障礙是許多蔬菜[1]、中藥材[2]、果樹[3]以及大田作物[4]在連年不間斷種植的情況下都會出現(xiàn)的一種現(xiàn)象，作物表現(xiàn)為生長發(fā)育不良、易感染病蟲害、產(chǎn)量和品質(zhì)下降等[5-6]。草莓作為我國重要的園藝作物，由于耕地面積有限，大多在溫室進(jìn)行連續(xù)種植，因此，面臨著嚴(yán)重的連作障礙[7-8]。

引發(fā)連作障礙的原因復(fù)雜，但其歸根結(jié)底是由于土壤環(huán)境的變化[9]。連年種植單一作物導(dǎo)致土壤微生物區(qū)系和多樣性失衡，有益微生物逐年減少、病原微生物逐漸富集，導(dǎo)致植物受到病菌侵染的概率增加[10-11]。因此，緩解連作障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一就是調(diào)節(jié)土壤微生物的數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)。

目前，生產(chǎn)上采取多種手段結(jié)合的綜合治理方法來處理連作土壤[12-13]，例如，首先對連作土壤進(jìn)行消毒處理，殺死土壤中積累的有害微生物[14]，然后通過添加有機(jī)肥或者微生物菌劑等來改良土壤環(huán)境，不僅能增加土壤的營養(yǎng)成分，同時還能調(diào)節(jié)土壤中微生物的多樣性，滿足植物生長對于土壤環(huán)境的需求，可有效緩解連作障礙。張慶華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，采用棉隆消毒和生物菌肥處理草莓連作土壤，可降低微生物真菌群落的多樣性，并減少或殺死土壤中的大部分致病菌屬，起到有效防治草莓土傳病害的作用，但該研究并沒有涉及細(xì)菌多樣性的變化。

敵磺鈉又名敵克松，化學(xué)名稱為對二甲胺基苯重氮磺酸鈉，是一種常用的有殺菌作用的土壤處理劑[16]，其對真菌中腐霉菌、黑穗病菌及多種土傳病害有效，屬于保護(hù)性藥劑，目前并沒有文章報道過這類型殺菌劑對于土壤微生物多樣性的影響，也沒有其與微生物菌劑聯(lián)合使用的相關(guān)研究。

為了進(jìn)一步研究克服和消除草莓連作障礙的有效方法，本研究利用MiSeq 高通量測序平臺[17-20]，選擇敵磺鈉處理與微生物菌肥結(jié)合的方式處理連續(xù)3 a 種植草莓的土壤，一方面探索連作土壤在敵磺鈉處理前后的微生物區(qū)系變化，另一方面研究分析不同肥料在調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系上的差異，從而更加全面地了解殺菌劑和微生物菌肥對土壤的作用，旨在為科學(xué)種植草莓提供全面詳細(xì)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試草莓品種為紅顏；化肥為史丹利復(fù)合肥；有機(jī)肥料為雞糞堆肥，購自平遙縣潤生態(tài)肥業(yè)有限公司；綠隴復(fù)合微生物菌劑，購自山東綠隴生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 對連作土壤進(jìn)行消毒處理 田間試驗在榆次市東陽鎮(zhèn)試驗基地進(jìn)行，試驗地土壤為連作3 a種植草莓的土壤。將上茬草莓植株清理干凈，用旋耕機(jī)進(jìn)行土壤旋耕，深度達(dá)到30～40 cm，均勻噴灑敵磺鈉溶液（70%可溶性粉劑15.00～18.75 kg/hm2，溶于100～150 kg 水中），處理3 d 后進(jìn)行分析。

對消毒前后的土壤進(jìn)行取樣并分析，土樣編號消毒前為A，消毒后為B。各個土壤處理采取5 點取樣法，并充分混勻，用于土壤微生物分析。

測試土壤的成分為：總氮含量1.95 g/kg，有效氮22.36 mg/kg，有效磷16.85 mg/kg，有效鉀232 mg/kg，pH 值6.8。

1.2.2 對連作土壤進(jìn)行施肥處理 在消毒后的土壤上進(jìn)行化肥、有機(jī)肥和微生物菌肥對草莓根際微生物多樣性的研究，試驗設(shè)3 個施肥處理，即處理1.底施傳統(tǒng)化學(xué)肥料（復(fù)合肥750 kg/hm2，過磷酸鈣600 kg/hm2）（CK）；處理2.底施普通有機(jī)肥（3 000 kg/hm2）（OF）；處理3.底施微生物菌肥和有機(jī)肥（將綠隴復(fù)合微生物菌劑（有效活菌數(shù)≥200 億個/g，用量7.5 kg/hm2）與有機(jī)肥混合，3 000 kg/hm2）（MF）。每個處理3 個重復(fù)，共9 個小區(qū)（15.0 m×4.5 m）。

草莓種植壟壟寬為0.45 m，間距為1.0 m，草莓分2 排種植于壟上，2 排間距為25 cm，每排的株間距為15 cm。在草莓生長期可追肥1～2 次，每次施肥75～120 kg/hm2。

1.3 樣品采集

在草莓進(jìn)入盛花期時采集土壤樣品。采樣時將草莓植株從土壤中整體挖出，將與根系緊密結(jié)合的土壤小心刷下來作為根際土壤樣品。每個小區(qū)按照對角線5 點取樣，每點取樣3 株，然后將15 株草莓的根際土壤混合成為1 個土壤樣品。

1.4 生物信息學(xué)分析方法

將土樣充分混勻后，送至上海派森諾生物科技有限公司完成真菌和細(xì)菌的高通量測序和分析。

1.4.1 Alpha 多樣性分析 使用QIIME 軟件分別計算每個樣本的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)，其中，群落豐富度用Chao1 指數(shù)描述，其可以估計群落中實際存在的物種數(shù)，數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高；物種多樣性用Shannon 指數(shù)描述，其可以反映樣品的多樣性程度，數(shù)值越高表明群落物種（程度）種類越豐富。

1.4.2 分類學(xué)組成分析 根據(jù)OUT 矩陣數(shù)據(jù)，使用QIIME 軟件，獲取各樣本在門和屬2 個分類水平上的組成和豐度分布表，比較不同樣品的群落組成，分析樣品間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓根際土壤Alpha 多樣性分析

2.1.1 細(xì)菌Alpha 多樣性分析 比較樣品A（未處理土壤）和B（敵磺鈉處理后土壤）的指數(shù)發(fā)現(xiàn)，敵磺鈉處理后土壤細(xì)菌的Chao1 指數(shù)要高于未處理的連作土壤，而Shannon 指數(shù)則是敵磺鈉處理后土壤低于未處理的連作土壤。說明敵磺鈉消毒后的土壤細(xì)菌的物種數(shù)升高，而細(xì)菌多樣性降低了（表1）。

表1 不同處理土壤群落豐富度和多樣性指數(shù)

綜合分析表1 中的3 個處理組的細(xì)菌多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌物種數(shù)目的改變和多樣性的變化正好相反，Chao1 指數(shù)由高到低排列順序為CK＞OF＞MF；Shannon 指數(shù)由高到低排列順序為MF＞OF＞CK。種植草莓后，其根際土壤的細(xì)菌豐富度都有所升高，對照組的指數(shù)是最高的，說明作物對于土壤細(xì)菌物種數(shù)的增加起重要作用；有機(jī)肥對于物種數(shù)的增加效果要好于微生物菌肥，這可能是因為后者自身細(xì)菌的影響。與對照組相比，有機(jī)肥和微生物菌肥都提高了細(xì)菌多樣性，尤其是微生物菌肥對細(xì)菌多樣性的提高更加明顯。

2.1.2 真菌Alpha 多樣性分析 由表1 可知，樣品A 真菌的Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)極高，說明連作土壤中真菌種類豐富、多樣性極高；而B 的2 個指數(shù)都很低，證明敵磺鈉對土壤中真菌的殺菌效果十分明顯。

分析B 和3 個處理組的Chao1 指數(shù)發(fā)現(xiàn)，CK、OF 和MF 的物種數(shù)相差不多，但是較B 均得到了提高，分別提高了2.74 倍、2.67 倍和2.81 倍；與A的差距仍然十分明顯，都不足A 的1/3。說明草莓的種植增加了土壤中的真菌物種數(shù)，3 個處理組的物種數(shù)相差不多，而施肥方式并沒有明顯影響土壤中真菌的物種數(shù)。

分析B 和3 個處理組的Shannon 指數(shù)發(fā)現(xiàn)，CK、OF 和MF 的指數(shù)要高出B 很多，說明草莓的種植明顯改善了敵磺鈉處理后土壤的真菌多樣性。同時發(fā)現(xiàn)，CK 的指數(shù)與A 較為接近，而OF 和MF 則與A 相差較大，這充分說明化肥對于土壤真菌多樣性的調(diào)節(jié)作用有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有機(jī)肥和微生物菌肥對于土壤真菌多樣性的影響。

2.2 群落門分類水平組成分析

2.2.1 細(xì)菌群落門水平組成分析 5 個不同處理草莓土壤（或根際土壤）中檢測出的細(xì)菌（豐度值大于1%）主要來自于變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、[thermi]門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、od1 門和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）。

從圖1 可以看出，B 的變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和[thermi]門的豐度值明顯要高于A，尤其是擬桿菌門，豐度值的增加十分明顯；其余門的豐度值均下降。說明敵磺鈉可以改變土壤中某些細(xì)菌群落在門水平上的相對豐度值。

分析3 個處理組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），變形菌門和放線菌門是每個處理的優(yōu)勢細(xì)菌門；MF 的變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、[thermi]門和藍(lán)藻門的豐度值是最高的；OF 的浮霉菌門、擬桿菌門和od1 門最高；芽單胞菌門和疣微菌門則在CK 中最高。微生物菌肥施用后，土壤中門水平上豐度值最高的細(xì)菌門最多，有機(jī)肥次之，而對照組最少。說明在改變細(xì)菌群落上的作用方面，微生物菌肥的作用要大于有機(jī)肥的作用。

2.2.2 真菌群落門水平組成分析 5 個不同處理草莓土壤（或根際土壤）中檢測出的真菌主要來自6 個門（圖3，4），包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）和壺菌門（Chytridiomycot）。其中，子囊菌門是5 個處理中豐度值占絕對優(yōu)勢的真菌門，在B 中的豐度值達(dá)到了99.21%，高于A；在OF 中的豐度值要高于其他2 個施肥處理組。

除了子囊菌門之外，敵磺鈉處理對其他門水平上的真菌豐度值影響很大，有3 個門的豐度值都降為0，說明敵磺鈉殺真菌的效果比較顯著，而且很有針對性；隨著草莓的種植以及肥料的施用，真菌的種類及豐度值均有所恢復(fù)，但是無論是何種施肥方式處理，子囊菌門仍然保持其主要地位。

2.3 群落屬分類水平組成分析

2.3.1 細(xì)菌屬分類水平組成分析 5 個不同處理草莓土壤（或根際土壤）中檢測出的豐度值為0.5%的有15 個屬（圖3），其中，變形菌門有4 個屬，放線菌門有5 個屬，浮霉菌門有1 個屬，綠彎菌門有2個屬，厚壁菌門有1 個屬，[thermi]門有1 個屬，疣微菌門有1 個屬。

由圖5 可知，經(jīng)過敵磺鈉處理后，土壤中的假單胞菌屬（Pseudomonas）、藤黃單胞菌屬（Luteimonas）、海 桿 菌 屬（Marinobacter）、溶 桿 菌 屬（Lysobacter）、犁頭霉屬（Planctomyces）、馬拉杜拉放線菌屬（Actinomadura）和B-42 屬的豐度值升高，其余屬的豐度值均降低，另外，Methylocaldum 和席藻（Phormidium）的豐度值變成0。

從圖6 可以看出，MF 的假單胞菌屬、藤黃單胞菌屬、溶桿菌屬、鏈霉菌屬（Streptomyces）、綠線菌屬（Chloronema）、芽孢桿菌（Bacillus）和B-42 屬的豐度值均高于其余2 個處理組，其中，假單胞菌屬、鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬的細(xì)菌多為生物防治中使用的益生菌，說明微生物菌肥的使用提高了土壤中傳統(tǒng)益生菌的比例。

2.3.2 真菌群落在屬水平上的豐度變化 5 個土壤樣品中檢測出的總豐度值在0.5%以上的屬共有5個（圖7，8），其中，子囊菌門有4 個屬，擔(dān)子菌門有1 個屬；總豐度值在1%以上的只有足孢子菌屬（Podospora）和嗜熱真菌（Mycothermus）。

從圖7 可以看出，B 的豐度值均低于A，足孢子菌屬的豐度值降低為0，說明敵磺鈉對于真菌屬水平的影響較大；而由圖8 可知，足孢子菌屬在MF中豐度值最高，CK 中最低，其余屬在3 個處理組中差異很小，施肥處理對真菌群落在屬水平上的變化存在一定影響。

3 結(jié)論與討論

健康土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)處于一種良好的平衡狀態(tài)，單一作物的連續(xù)種植導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致土壤中微生物群落發(fā)生變化，有益微生物處于劣勢，而有害微生物則占據(jù)了優(yōu)勢，尤其是土壤中病原真菌的比例會大大增加[12]。

3.1 敵磺鈉對于土壤微生物多樣性的影響

敵磺鈉是一種常用的土壤土傳病害的殺菌劑[21-22]，本研究結(jié)果表明，敵磺鈉對于土壤真菌的多樣性影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對于細(xì)菌多樣性的影響。從多樣性指數(shù)分析，經(jīng)過敵磺鈉處理后的草莓連作土壤，真菌的Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)都顯著降低。這與張慶華等[15]施用棉隆消毒后土壤真菌群落豐度及其生物多樣性均下降的研究結(jié)果相似。敵磺鈉對于細(xì)菌多樣性的影響結(jié)果表明，處理后細(xì)菌的Shannon 指數(shù)降低，而Chao1 指數(shù)反而上升。伍朝榮等[23]研究表明，在厭氧消毒法處理土壤后，其細(xì)菌的Chao1 指數(shù)反而升高，而Shannon 指數(shù)略有降低，其結(jié)果與本研究相類似。

敵磺鈉對細(xì)菌在門分類水平上的組成沒有顯著影響，在豐度值上有一定改變，而且變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和[thermi]門在敵磺鈉處理之后豐度值升高。敵磺鈉對于真菌群落在門分類水平組成的影響很大，敵磺鈉處理之后土壤中真菌門有3 個豐度值為0，子囊菌門的相對豐度值還大大增加，占到了99.20%。這與張慶華[15]的試驗結(jié)果一致，棉隆處理后，只有子囊菌門的豐度值增加，但是并沒有增加很多，由40.91%增加至57.25%。土壤經(jīng)過處理之后，真菌的種類和多樣性都大大降低。

在屬水平上，敵磺鈉處理后，有2 個細(xì)菌屬的豐度值為0，有7 個屬的豐度值升高；僅有1 個真菌屬的豐度值成為0，沒有屬的豐度值升高。在殺菌能力上，敵磺鈉對于真菌具有很強(qiáng)的針對性。

綜上所述，敵磺納處理后，土壤微生物多樣性發(fā)生了極大的改變，幾乎處于一種類似“真空”的狀態(tài)[15]，可以說達(dá)到了處理土壤的目的。但是這樣的土壤并不適合進(jìn)行植株的種植，還需要通過一些方法調(diào)節(jié)土壤的微生物群落才可以達(dá)到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的要求。

3.2 不同施肥方式對土壤微生物的影響

土壤進(jìn)行消毒處理之后，需要對土壤進(jìn)行恢復(fù)性調(diào)節(jié)，本試驗采用了有機(jī)肥和微生物肥2 種施肥方式進(jìn)行土壤微生物調(diào)節(jié)。

研究表明，不同類型外源有機(jī)物的投入對土壤微生物種群數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu)的影響存在著顯著性差異[24-26]。施用有機(jī)肥或者微生物有機(jī)肥不僅可以增進(jìn)土壤肥力，而且能改善作物根系微生態(tài)環(huán)境中的理化性狀，從而提高有益微生物活性及作物的抗病能力[27]。

本試驗發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥和微生物菌肥的施用提高了細(xì)菌的多樣性，降低了真菌的多樣性，符合健康的“細(xì)菌型”土壤的標(biāo)準(zhǔn)。說明有機(jī)肥和微生物肥都能夠有效地改良土壤環(huán)境。這與很多研究結(jié)果一致，付琳[28]在試驗中發(fā)現(xiàn)，微生物肥改變了香蕉根際土壤細(xì)菌和真菌的群落組成，降低了根際土壤中真菌的豐度并增加了細(xì)菌的豐度和多樣性。朱菲瑩等[29]研究表明，棉?。镉袡C(jī)肥的處理組中土壤細(xì)菌多樣性最高，而且芽孢桿菌屬Bacillus 的豐度值也是最高的，對西瓜枯萎病防治效果最好。

在門水平組成分類上，草莓根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門和放線菌門，而子囊菌門則是真菌中的優(yōu)勢門，豐度值占絕對比例。微生物肥處理組有6 個細(xì)菌門（變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、[thermi]門和藍(lán)藻門）的豐度值最高；有機(jī)肥處理組有4 個細(xì)菌門（浮霉菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和od1 門）最高；對照組只有2 個細(xì)菌門（芽單胞菌門和疣微菌門）的豐度值最高。真菌門水平則因為子囊菌門的絕對優(yōu)勢，導(dǎo)致其他的真菌門豐度值都很低。肥料的施用對于細(xì)菌門水平的影響要大于真菌門水平的影響，而微生物菌肥的影響又大于有機(jī)肥的影響。

在細(xì)菌的屬水平上，微生物肥處理后，有7 個屬的細(xì)菌豐度值要高于有機(jī)肥組和對照組，其中包括假單胞菌屬、鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬，而這3 個屬的細(xì)菌大多是有益菌。付琳等[28]研究也證實，微生物肥的加入提高了根際細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，并誘導(dǎo)了巨大芽孢桿菌、熒光假單胞菌和放線菌的富集。朱菲瑩等[29]研究證實，在棉?。镉袡C(jī)肥的處理組中，土壤細(xì)菌多樣性最高，而且芽孢桿菌屬的豐度值也是最高的，對西瓜枯萎病防治效果最好?？梢哉f微生物肥的加入使得土壤中有益細(xì)菌的豐度值增加，更容易發(fā)揮生物防治的效果，比起其他2 種肥料來說，改良土壤環(huán)境的能力更強(qiáng)。與此相反，真菌群落在屬水平上的變化并不明顯，其中，足孢子菌屬在微生物肥處理后豐度值最高，其余的4 個屬均是對照組的豐度值最高。

3.3 連作土壤處理的最佳組合

本研究針對草莓連作土壤的處理分為2 步，首先采取化學(xué)手段進(jìn)行土壤殺菌，草莓土傳病害主要是真菌性病害[30]，所以敵磺鈉的施用對于真菌有效果良好；其次采用有機(jī)肥和微生物肥料進(jìn)行土壤微生物以及根際土壤群落結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，效果最好的是微生物肥，經(jīng)過處理后土壤的真菌多樣性降低，細(xì)菌的多樣性提高，同時，有益菌包括假單胞菌屬[31]、鏈霉菌屬[32-33]和芽孢桿菌屬[34]在草莓的根際成功定殖，將連作土壤恢復(fù)成適合草莓植株生長的土壤環(huán)境。張慶華等[15]研究認(rèn)為，采用棉隆和添加生物菌肥相結(jié)合的方式可為草莓根際微生物（真菌群落）提供更有利的生長環(huán)境，也為土傳病害的有效防治和生物菌肥高效利用提供理論依據(jù)，其研究結(jié)論與本研究基本一致。朱菲瑩等[29]研究也認(rèn)為，棉隆對土壤熏蒸消毒的作用加上生物有機(jī)肥施用后對土壤生態(tài)系統(tǒng)的重建（尤其是細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)），有利于西瓜植株的健康生長。

連作土壤的處理是一個需要結(jié)合多種手段的綜合治理過程，目前使用較多的方法就是先治再調(diào)，也取得了一定的效果，微生物群落多樣性的分析有助于了解土壤在受到外界干擾時內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化，幫助我們了解處理手段的優(yōu)劣，從而找到合適的處理手段。但是，土壤環(huán)境的復(fù)雜性決定了其受多種因素所調(diào)節(jié)[35]，所以，還需要進(jìn)行很多更加深入透徹的研究，才能為綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。