復(fù)方五鳳草液對(duì)家兔結(jié)核性潰瘍iNOS、Arg-1的影響*

黃子慧，余 洋，錢佳燕，朱思洵

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

結(jié)核性潰瘍(Tuberculosis ulcer)是指結(jié)核分枝桿菌(MTB)[1]經(jīng)各種傳播路徑侵犯機(jī)體局部組織，引起病灶周圍軟組織、皮下及皮膚的壞死，最終液化破潰而形成的創(chuàng)面，屬于肺外結(jié)核，是世界上首要的感染性疾病[2]——結(jié)核病疫情的重要組成部分。表現(xiàn)為創(chuàng)面膿水淋漓，纏綿難愈，或假性愈合后反復(fù)發(fā)作，是臨床常見的一種慢性難愈性創(chuàng)面。復(fù)方五鳳草液為我院協(xié)定方，外用治療結(jié)核性潰瘍近20 a，臨床療效滿意[3]。目前已知巨噬細(xì)胞在參與慢性創(chuàng)面修復(fù)的眾多細(xì)胞中起到了總指揮的作用[4]，可塑性較強(qiáng),不同的微環(huán)境可極化為M 1和M 2兩種不同的類型[5]，其中M 1型主要參與炎癥產(chǎn)生的起始和維持；M 2型主要參與組織修復(fù)。M 1向M 2型轉(zhuǎn)換是創(chuàng)面由炎癥反應(yīng)轉(zhuǎn)為修復(fù)性反應(yīng)的關(guān)鍵[6]。而在結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面組織液化壞死高峰期時(shí)，M 1型數(shù)量明顯多于M 2型[7]。本次實(shí)驗(yàn)，筆者構(gòu)建結(jié)核性潰瘍家兔模型,分別選擇M 1、M 2型巨噬細(xì)胞的表型指標(biāo)iNOS、Arg-1[8]進(jìn)行觀察，比較各模型家兔在藥物干預(yù)過程中組織及血清中指標(biāo)的變化，以此從巨噬細(xì)胞極化角度來探討復(fù)方五鳳草液有效促進(jìn)結(jié)核性潰瘍愈合的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD新西蘭兔42只，體質(zhì)量約200 g～220 g，平均(206.56±9.26)g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0008。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

復(fù)方五鳳草液處方：五鳳草2 000 g白及240 g，貓爪草400 g等。制備工藝：將以上諸藥，加水浸過藥面，煎煮3次，每次1 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮分裝，生藥含量為2.64 g/mL(此為高劑量組)。將該藥液分別稀釋2倍、5倍，制成中、低劑量組。以上藥液由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室提供，用4 ℃冰箱保存；異煙肼針劑(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)H12020970)；親水性纖維含銀輔料[康維德(中國(guó))醫(yī)療用品有限公司，批號(hào)7E04803]。

1.1.3 主要試劑

兔誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(型號(hào)：CSB-E08327Rb廠家：武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：N28036105)，L-精氨酸(型號(hào)：A137768廠家：上海阿拉丁生化科技股份有限公司),a-異亞硝基苯丙酮(型號(hào)：119-51-7；廠家：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及造模

將新西蘭兔隨機(jī)分為①空白組(普通潰瘍組)；②模型組(結(jié)核性潰瘍組)；③陽(yáng)性藥1組(異煙肼組)；④陽(yáng)性藥2組(親水性纖維含銀輔料組)；⑤復(fù)方五鳳草液高劑量組；⑥復(fù)方五鳳草液中劑量組；⑦復(fù)方五鳳草液低劑量組。每組6只。

結(jié)核性潰瘍模型制備：將凍存于-80 ℃BCG菌種(蘭州大學(xué)結(jié)核病研究中心暨病原生物學(xué)研究所提供)取出，刮取菌落研磨，研磨后的菌體接種于7H9液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增菌，菌落計(jì)數(shù)，確定菌液濃度，收集離心管沉淀細(xì)菌，新西蘭兔在常規(guī)飼養(yǎng)1周后，腹腔注射鹽酸氯胺酮(150 mg/kg體質(zhì)量)麻醉，在造模區(qū)(兩側(cè)腹背部)剃毛，接種100 μL。6周后以相同劑量再次皮下注射免疫，大概免疫后4周，見皮膚病理改變(可見類上皮增生為主的結(jié)核肉芽腫，并可見朗罕氏細(xì)胞)。

2.2 換藥方法

造模完成后換藥，用75 %的酒精棉球消毒創(chuàng)周皮膚，先由創(chuàng)面周圍開始,做圓圈狀向心性擦拭,致創(chuàng)面邊緣，以鹽水棉球輕輕擦拭創(chuàng)面膿性分泌物。治療組、異煙肼組以5 mL藥液浸濕無菌棉片外敷創(chuàng)面、親水性纖維含銀輔料組根據(jù)創(chuàng)面的面積剪取適合輔料外敷創(chuàng)面、模型組予以普通油紗外敷、空白組建立全層皮膚缺損模型，予以普通油紗外敷。各組均外蓋兩層滅菌干紗布，膠布固定。隔日換藥1次。

2.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集

造模成功后給藥前以及給藥后第3、7、14、21天分別采取創(chuàng)面相同部位肉芽組織及血清。將所采集標(biāo)本放置-80 ℃冰箱。標(biāo)本采集完全后，酶聯(lián)免疫分析iNOS含量，Arg-1生化活性檢測(cè)。

3 檢測(cè)方法

3.1 酶聯(lián)免疫分析iNOS含量

將原倍標(biāo)準(zhǔn)品在EP管中進(jìn)行稀釋400,200,100,50,25,12.5,6.252,0(U/mL)，分別設(shè)空白孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本100 μL，輕輕搖晃96孔板，覆上板貼，37 ℃溫育2 h。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，覆上新板貼，37 ℃溫育1h。棄去液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，200 μL每孔，甩干。每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100 μL，覆上新板貼，37 ℃溫育1 h。棄去液體，甩干，洗板5次，每次浸泡 2 min，200 μL每孔，甩干。依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色15 min～30 min。依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

3.2 Arg-1生化活性檢測(cè)

分別配制0.5 mol/L L-精氨酸、H2SO4/H3PO4(H2SO4∶H3PO4∶H2O=1∶3∶7)、9 % α-異亞硝基苯丙酮、10 μmol/mL尿素，10 μmol/mL尿素梯度稀釋32倍至0.3125 μmol/mL后，按兩倍梯度稀釋0.3125/2,0.3125/4,0.3125/8,0.3125/16,0.3125/32 μmol/mL。分別設(shè)空白孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔。每孔分別加100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本和0.5 mol/L L-精氨酸，37 ℃溫育30 min。加入800 μL H2SO4/H3PO4后，每孔加入50 μL 9 % α-異亞硝基苯丙酮，95 ℃溫育30 min。540 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3.4 結(jié) 果

3.4.1 家兔創(chuàng)面組織及血清中iNOS含量

模型組自造模第3天起iNOS升高，之后無明顯變化，其余各組創(chuàng)面組織及血清中iNOS含量呈升高—降低趨勢(shì)(P<0.01)。第3天，各組iNOS含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第7天，空白組iNOS含量較前相比明顯降低(P<0.05)，與其他組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14、21天：各組與前一時(shí)間點(diǎn)相比iNOS含量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，復(fù)方五鳳草液高、中劑量組、空白組與其他各組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，復(fù)方五鳳草液高、中劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，親水性纖維含銀輔料組、復(fù)方五鳳草液低劑量組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔創(chuàng)面組織中iNOS含量比較

表2 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔血清中iNOS含量比較

3.4.2 家兔創(chuàng)面組織及血清中Arg-1活性檢測(cè)

除了模型組之外其他各組家兔隨時(shí)間變化肉芽組織及血清中Arg-1活性檢測(cè)數(shù)值都呈現(xiàn)增高趨勢(shì)(P<0.05)。治療第3天，各組Arg-1含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療第7天，空白組與其他各組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療第14天，空白組、復(fù)方五鳳草液高、中劑量組Arg-1含量增高，與前一時(shí)間點(diǎn)相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與其他各組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療第21天，空白組、復(fù)方五鳳草液高、中劑量組與其他各組相比Arg-1含量增高明顯(P<0.01)。見表3、表4。

表3 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔創(chuàng)面組織中Arg-1活性檢測(cè)表達(dá)比較

表4 各時(shí)間點(diǎn)各組家兔血清中Arg-1活性檢測(cè)表達(dá)比較

4 討 論

結(jié)核性潰瘍是臨床常見的一種慢性難愈性創(chuàng)面，病程遷延，屬臨床難治痼疾。抗結(jié)核藥物化療是基礎(chǔ)治療，局部外治起到關(guān)鍵作用。近年來，糖尿病[9]、HIV感染者合并TB發(fā)病率逐年增加[10]，以及DR-TB甚至甚至XDR-TB[11]的日益增多，使得本病的發(fā)病率以及治療難度都會(huì)增加。然而，目前對(duì)結(jié)核性潰瘍的臨床及機(jī)理研究尚且薄弱。

祖國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥在慢性創(chuàng)面的修復(fù)中具有明顯優(yōu)勢(shì)。復(fù)方五鳳草液為我院名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，結(jié)合其病機(jī)特點(diǎn)“腐肉難去、新肉不生”研制而成，應(yīng)用于臨床20 a余，療效確切。該復(fù)方由五鳳草、白及、貓爪草等組方而成。其中五鳳草行水殺蟲，祛腐解毒；白及生肌斂瘡，止血活血；貓爪草解毒提膿，祛腐消腫。諸藥合用，共奏提膿祛腐、活血生肌之效，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。前期研究表明，該藥物能更有效地抑制創(chuàng)面TB-PCRct值，促進(jìn)VEGF、FGF-2的表達(dá)，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，提高創(chuàng)面愈合率[12]。

在創(chuàng)面愈合過程中[13]，巨噬細(xì)胞活化扮演了重要的角色。正常生理狀態(tài)下，M 1型(即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞)出現(xiàn)在創(chuàng)面愈合的早期，促進(jìn)創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，隨后在創(chuàng)面浸潤(rùn)密度逐漸降低，轉(zhuǎn)變?yōu)镸 2型(替代性活化的巨噬細(xì)胞)，促進(jìn)創(chuàng)面的細(xì)胞增殖和血管化的形成，完成愈合的整個(gè)過程。而在結(jié)核性潰瘍中，由于入侵的結(jié)核桿菌寄宿于巨噬細(xì)胞[14]，導(dǎo)致局部特殊微環(huán)境的改變，影響巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)和活化方式[15]，使得M 1型和M 2型巨噬細(xì)胞無法如正常創(chuàng)面進(jìn)行時(shí)像過渡，在臨床中則表現(xiàn)為難愈創(chuàng)面中異常炎癥滯留和新生肉芽組織減少的狀態(tài)[16]，即造成“腐肉難去，新肉不生”的局面，導(dǎo)致創(chuàng)面遲遲不愈。因此繆明遠(yuǎn)等[17]認(rèn)為，抑制難愈性創(chuàng)面修復(fù)后期仍異?；钴S的M 1型活化，促使M 2型活化重新占據(jù)主導(dǎo)地位，使其接近正常創(chuàng)面M 1和M 2型活化的時(shí)像過渡，可能是今后治療的一個(gè)研究方向。

本次實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇了M 1、M 2型巨噬細(xì)胞的表型指標(biāo)iNOS、Arg-1進(jìn)行觀察，比較各組家兔在治療過程中血清及組織中指標(biāo)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①空白家兔早期iNOS高表達(dá)，7 d后逐漸下降，同時(shí)Arg-1表達(dá)漸增加，表現(xiàn)為創(chuàng)面漸趨愈合。而結(jié)核性潰瘍模型家兔在整個(gè)觀察期間iNOS始終處于高表達(dá)狀態(tài)、Arg-1始終處于低表達(dá)狀態(tài)，創(chuàng)面愈合較差。②治療組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，各組3 d組織及血液中iNOS相比均無顯著性差異。7 d開始各組組織及血液中iNOS表達(dá)均比治療初起下降，其中14 d、21 d，治療組高中低濃度三組組織中iNOS下降明顯，與治療初期相比(P<0.01)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同樣在治療14 d、21 d，治療組高中低濃度三組血清中iNOS下降與治療初期相比(P<0.05)，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③治療組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，各組3 d、7 d組織及血液中Arg-1相比均無顯著性差異(P>0.05)。高、中劑量組創(chuàng)面組織中Arg-1在14 d、21 d與治療初期相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組組織中Arg-1在21 d與治療初期相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高、中劑量組14 d、21 d與其余給藥組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；7 d各組血清中Arg-1的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，14 d除高劑量組治療初期相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，21 d 各組與治療初起相比血清中Arg-1的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組與其余各給藥組相比血清中Arg-1的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在結(jié)核性潰瘍中，iNOS持續(xù)高表達(dá)，而Arg-1 含量偏低，這點(diǎn)與汪毅平的研究相符[7]。同時(shí)相比于陽(yáng)性對(duì)照組，在治療中后期復(fù)方五鳳草液組能更有效地抑制iNOS的表達(dá)，提高Arg-1的含量，與此相應(yīng)的創(chuàng)面愈合率也高于對(duì)照組，而其中高、中劑量組的表現(xiàn)更優(yōu)于低劑量組。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)血液、組織中兩個(gè)指標(biāo)具有同步性，兩者相比組織中指標(biāo)變化更為敏感。

通過本次實(shí)驗(yàn)，筆者認(rèn)為，結(jié)核性潰瘍之所以纏綿難愈，可能與巨噬細(xì)胞活化失衡有關(guān)，復(fù)方五鳳草液可能參與了巨噬細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)，通過抑制iNOS的過渡表達(dá)、促進(jìn)Arg-1的表達(dá)來發(fā)揮創(chuàng)面修復(fù)的作用。本次試驗(yàn)僅觀察2個(gè)指標(biāo)，要闡述疾病的機(jī)制顯然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。但是本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為我們從巨噬細(xì)胞極化角度開展結(jié)核性潰瘍更深入的機(jī)理研究提供方向和基礎(chǔ)，也使得將該復(fù)方中藥進(jìn)一步拓展應(yīng)用于其他慢性創(chuàng)面從理論上成為可能。需要我們開展更深入的動(dòng)物藥效試驗(yàn)及機(jī)制研究去探索與證實(shí)，目前相關(guān)工作正在進(jìn)行中。