206例非綜合征型聽障兒童聽力學(xué)及基因型分析

林穎 黃利芬 周楓 張群慧

全國流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing impairment，NSHI）最常見的致聾基因為GJB2、SLC26A4、線粒體基因，聽力表型多變。隨著孕前、產(chǎn)前診斷、新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的普及[1，2]，可以盡早發(fā)現(xiàn)耳聾患兒并實施干預(yù)，對于學(xué)齡期孩子，尤其是特殊學(xué)校的孩子，聽力學(xué)與耳聾基因的檢測亦是客觀評估其聽力情況的重要手段。頻率特異性高的聽覺多頻穩(wěn)態(tài)誘發(fā)電位（ASSR）作為一項客觀性強(qiáng)的電生理技術(shù)，已廣泛運用于臨床聽力的評估，尤其是嬰幼兒、聽力障礙及職業(yè)性偽聾等人群。本研究應(yīng)用聽力學(xué)及耳聾基因篩查對206例重度以上感音神經(jīng)性非綜合征型耳聾患者進(jìn)行綜合分析，探討ASSR與PTA的相關(guān)性，及該學(xué)校的耳聾分子病因構(gòu)成。

1 資料與方法

1.1 一般資料

廣州市某特殊學(xué)校非綜合征型耳聾漢族患者206例（412耳），其中男97例，女109例，年齡7～24歲（中位數(shù)年齡15歲）。排除全身器質(zhì)性病變或合并其他遺傳疾病，中耳炎等耳部疾病，詳細(xì)病史采集，填寫受檢者基本信息、耳聾家族史、噪音接觸史及以往用藥史，并按照我院倫理委員會規(guī)定簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 純音聽閾測定及聲導(dǎo)抗檢測 檢測前，經(jīng)過耳鼻咽喉常規(guī)檢查，清除外耳道及鼓膜表面分泌物。采用GSI61診斷聽力計（升降法）及GSITympstar中耳分析儀（226 Hz探測音）。

1.2.2 ABR與ASSR檢測 受試者口服10%水合氯醛溶液，平躺于測試床上，待其入睡后進(jìn)行。隔音室背景噪聲＜28 dB（A）加權(quán)。

選用Integrity V500聽性誘發(fā)電位診斷系統(tǒng)（VIVOSONIC，加拿大），ER-3A插入式耳機(jī)，短音刺激，0.1 ms，濾波100～3000 Hz，放大100000，掃描次數(shù)為1024，分析時間15 ms，電極Cz-Mi。分別檢測雙耳的ABR反應(yīng)閾值。ABR檢測時最大刺激強(qiáng)度90 dB nHL。ASSR采用Audera-Grason-Stadler測試系統(tǒng)進(jìn)行檢測，左右耳交替進(jìn)行。ASSR的刺激聲為單頻正弦調(diào)幅音，調(diào)制信號為AM100%、FM10%，載波頻率（CF）為0.5，1，2，4 kHz，調(diào)制頻率（MF）為74 Hz、81 Hz、88 Hz、89 Hz，刺激強(qiáng)度為50 dB nHL。選用TIP50插入式耳機(jī)，電極為紐扣式電極，分別置于前額發(fā)跡、眉間、雙側(cè)乳突。極間電阻＜5 Ω。

1.2.3 耳聾基因芯片篩查 采用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的《血液基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）》（貨號：DT319-02），從耳聾患者外周血中提取基因組DNA后，采用9項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（微陣列芯片法）（北京博奧生物有限公司，貨號300065）對DNA進(jìn)行GJB2(c.35delG，c.176del16，c.235delC及c.299_300delAT)，GJB3(c.538C＞T)，SLC26A4(c.919-2A＞G，c.2168A＞G)和MT-RNR1(m.1555A＞G，m.1494C＞T)9個熱點變異檢測。通過PCR、雜交、芯片洗滌、芯片掃描等步驟，最后分析系統(tǒng)自動判讀結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，將ASSR在0.5，1，2，4 kHz頻率處的反應(yīng)閾值（±s）分別與純音聽閾氣導(dǎo)閾值（±s）比較，對其進(jìn)行t檢驗、pearson相關(guān)分析、卡方檢驗及秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 純音聽閾結(jié)果

由于選取的患者均大于6歲，有較好的理解力，能順利完成純音聽閾測試。0.5，1，2，4 kHz頻率處的氣導(dǎo)反應(yīng)閾值見表1。

表1 非綜合征型耳聾患者純音聽閾氣導(dǎo)閾值（dB HL）

2.2 ABR結(jié)果

為了避免過度噪音，本實驗ABR檢測時設(shè)定為最大刺激強(qiáng)度90 dB nHL，因此206例（412耳）患者中僅18例（32耳）反應(yīng)閾值為90 dB nHL，其余均未引出分化明顯的各波形。

在18例反應(yīng)閾值為90 dB nHL的患者中，有3例（6耳）雙側(cè)前庭水管擴(kuò)大患者，高強(qiáng)度刺激下，3耳記錄到特殊負(fù)波——聲誘發(fā)短潛伏期負(fù)反應(yīng)（acoustically evoked short latency negative response，ASNR）[3]。此3耳（2左1右）ASNR分別來自不同的3人，刺激強(qiáng)度為90 dB nHL時可引出，潛伏期分別為3.05 ms、3.15 ms、3.23 ms，I～V波均分化差；當(dāng)刺激強(qiáng)度降低，則ASNR消失。另外3耳I～V波均消失。

2.3 ASSR結(jié)果

ASSR在0.5，1，2，4 kHz頻率處的反應(yīng)閾值與PTA反應(yīng)閾值的相關(guān)性分析見表2，表3。不同性別、左右耳的ASSR閾值與PTA不同頻率處的閾值均呈線性正相關(guān)。

表2 非綜合征型耳聾患者多頻穩(wěn)態(tài)閾值（dB HL）

2.4 基因芯片結(jié)果

共檢測出42例（20.39%）攜帶熱點變異基因患者，其中攜帶致聾基因GJB2者16例（7.77%）；攜帶SLC26A4者25例（12.14%），HRCT結(jié)果顯示25例全部為前庭水管擴(kuò)大或伴mondini畸形；攜帶MT--RNR1基因m.1555A＞G者1例（0.49%），見表4。需經(jīng)Sanger測序驗證，DNA測序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）公布的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行序列比對。

表3 多頻穩(wěn)態(tài)閾值與純音聽閾閾值的相關(guān)性

表4 基因芯片篩查結(jié)果

2.5 攜帶熱點基因與非攜帶基因患者的不同聽力損失例數(shù)分布情況

在206例非綜合征型耳聾患者中，42例攜帶熱點基因，其中19例為重度感音神經(jīng)性聾，23例為極重度感音神經(jīng)性聾，分別與基因芯片沒有檢測出熱點基因患者的不同聽力損失程度例數(shù)對比（表5），差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。1例攜帶MT-RNR1 m.1555 A＞G患者為極重度感音神經(jīng)性聾；16例攜帶GJB2、25例攜帶SLC26A4基因的患者中，極重度感音神經(jīng)性聾多于重度感音神經(jīng)性聾，兩組間不同聽力損失程度例數(shù)對比（表6），差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。純合變異攜帶者中有8人為重度感音神經(jīng)性聾，11人為極重度感音神經(jīng)性聾；而雜合變異攜帶者中各11人為重度及極重度感音神經(jīng)性聾，其語頻平均聽閾比較見表7，說明在攜帶基因的重度和極重度感音神經(jīng)性聾患者中，純合變異與雜合變異患者的聽力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

耳聾是導(dǎo)致言語交流障礙的常見疾病。準(zhǔn)確、客觀、盡早的評估聽力閾值至關(guān)重要，尤其對于無語言基礎(chǔ)和交流能力的嬰幼兒，以免喪失最佳言語康復(fù)時機(jī)。隨著電生理技術(shù)的飛躍式發(fā)展，具有頻率特異性、刺激強(qiáng)度大、測試結(jié)果判斷客觀等優(yōu)點[4，5]的ASSR的出現(xiàn)，受到了臨床廣泛關(guān)注與應(yīng)用；由于ABR主要反映耳蝸基底區(qū)域的活動，受刺激聲強(qiáng)度的限制，對最大強(qiáng)度聲刺激無反應(yīng)者，并不表示無殘余聽力。已有學(xué)者通過統(tǒng)計ASSR在各頻率的引出率及與ABR的相關(guān)性，證實ABR未能引出反應(yīng)的聾兒仍存在不同程度的殘余聽力。并且研究表明感音神經(jīng)性聾患者各頻率聽閾與ASSR具有顯著相關(guān)性[3]。隨著遺傳性耳聾基因診斷技術(shù)的快速發(fā)展及推廣，聽力學(xué)檢測聯(lián)合基因檢測更是為聾病患者的早期診斷、早期干預(yù)提供了可靠、有效的方法。

表5 攜帶耳聾相關(guān)熱點基因與非攜帶基因患者不同聽力損失程度例數(shù)分布

表6 GJB2、SLC26A4基因變異患者不同聽力損失程度例數(shù)分布

表7 GJB2、SLC26A4基因純合與雜合變異的平均語頻聽力比較（dB HL）

通量高、花費少、接受度廣的快速精準(zhǔn)診斷技術(shù)適用于各類人群常規(guī)臨床檢測，包括應(yīng)用氨基糖甙類藥物前的預(yù)防性檢查、耳聾病因?qū)W檢查、耳聾患者，特別是有耳聾家族史個體，耳蝸移植手術(shù)者、學(xué)齡前兒童、孕產(chǎn)婦廣譜篩查及任何年齡階段人群。雖然不同國家、地區(qū)、民族、年齡的致聾基因變異有差異性，但流行病學(xué)大數(shù)據(jù)顯示[6]，中國人4個常見的耳聾相關(guān)基因共9個熱點變異，包括GJB2(c.35delG，c.176del16，c.235delC及c.299_300delAT)，GJB3(c.538C＞T)，SLC26A4(c.919-2A＞G，c.2168A＞G)和線粒體DNA 12S rRNA(m.1555A＞G，m.1494C＞T)，是目前致聾的主要分子學(xué)基礎(chǔ)。9項耳聾基因芯片覆蓋了約80%的熱點致聾基因及位點，臨床上多與聽力學(xué)檢測結(jié)合，可以快速篩查耳聾患者的可能病因并客觀評估其聽力情況。

本研究對206例（412耳）非綜合征型耳聾患者進(jìn)行聽力檢測，純音聽閾結(jié)果均示重度以上感音神經(jīng)性聾，僅32耳反應(yīng)閾值為90 dB nHL，其余均未引出分化明顯的各波形；而其中3耳出現(xiàn)ASNR，此3例患者經(jīng)耳聾基因芯片、CT、測序均證實為雙側(cè)大前庭水管，而ASNR為大前庭水管患者ABR檢測中的特征波形。行ASSR檢測，在0.5、1、2、4 kHz頻率處的反應(yīng)閾值與PTA反應(yīng)閾值呈線性正相關(guān)，說明ASSR可以評估純音聽閾的閾值，進(jìn)而客觀判斷重度以上非綜合征型耳聾患者殘存聽力。

基因芯片篩查結(jié)果示，該聾校的GJB2基因總檢出率為7.77%，其中c.235delC純合變異12例（5.83%），雜合變異3例（1.46%），c.299_300delAT雜合變異變1例（0.49%），未檢測出c.35delG、c.176del16變異。SLC26A4總變異率13.83%，其中c.919-2A＞G純合變異7例（3.40%），雜合變異15例（7.28%），該位點的總攜帶率為10.68%；c.2168A＞G雜合變異2例（0.97%），1例為c.919-2A＞G/c.2168A＞G復(fù)合雜合變異。全國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)GJB2基因的總檢出率約為21%左右，c.235delC是中國人最常見的變異位點；SLC26A4基因總攜帶率約為15%左右，常見的位點為c.919-2A＞G和c.2168A＞G。本次篩查說明該聾校最常見的變異基因為SLC26A4和GJB2，且SLC26A4基因較GJB2基因略多。由于芯片篩查的位點有限，可能在其他外顯子上存在另一非熱點變異；基因突變存在明顯的異質(zhì)性、多態(tài)性，一般認(rèn)為雙等位基因突變可以導(dǎo)致表型的出現(xiàn)，可能在啟動子區(qū)或隱藏的剪接位點上存在某一些未被檢測到的突變位點；或者與單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異有關(guān)；還有可能由于環(huán)境因素的影響，或者有其他修飾基因共同參與致耳聾表型的產(chǎn)生[7]。而檢測出1例攜帶MT--RNR1基因m.1555A＞G者，說明線粒體基因變異在廣州該聾校較為少見。由于線粒體遺傳方式99.8%屬于母系遺傳（約0.02%為父親傳遞DNA）[8]，因此筆者對此患兒進(jìn)行嚴(yán)格的用藥指導(dǎo)并提供禁用氨基糖甙類藥物就診卡，將來婚配生育時，其子女應(yīng)避免此類藥物，盡量降低藥物性耳聾的發(fā)病率。

攜帶熱點基因與非攜帶基因患者的不同聽力損失例數(shù)分布情況僅說明本研究206例學(xué)生聽力損失程度為重度以上感音神經(jīng)性聾，攜帶熱點基因與非攜帶熱點基因患者的聽力損失程度無統(tǒng)計學(xué)差異；攜帶GJB2基因與攜帶SLC26A4基因患者的聽力損失程度亦無統(tǒng)計學(xué)差異，純合變異與雜合變異患者的語頻平均聽閾無統(tǒng)計學(xué)差異，符合GJB2、SLC26A4基因變異致聾的聽力學(xué)特點，聽力損失程度均以重度、極重度者居多[9]。

綜上所述，本研究通過聽力學(xué)檢查聯(lián)合基因芯片篩查，迅速、客觀、可靠的評估206例某聾校非綜征性耳聾患者的聽力情況與可能病因。結(jié)果提示GJB2、SLC26A4仍是此聾校的常見致聾基因；聽力損失程度為重度以上感音神經(jīng)性聾；ASSR可以客觀判斷殘存聽力。因此，臨床工作中可以聯(lián)合多種技術(shù)為患者提供準(zhǔn)確可靠的聽力及耳聾基因診斷，尤其對新生兒進(jìn)行聽力聯(lián)合熱點基因變異的篩查，可以實現(xiàn)對遺傳性耳聾患兒早期發(fā)現(xiàn)、診斷和干預(yù)，以防發(fā)生因聾致啞[10]。