氧化鐵納米顆粒通過誘導巨噬細胞釋放活性氧抑制膀胱癌的研究

齊 奧 付宜鳴 倪少濱

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,哈爾濱150001)

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有術后易復發(fā)的特點，術后五年復發(fā)率可達50%～70%，根據(jù)CA Cancer J Clinic報道其復發(fā)所導致的高額治療費用位于所有實體腫瘤之首[1-3]。導致膀胱癌復發(fā)的主要因素為術后腫瘤殘余以及游離腫瘤細胞再種植[4]。雖然術后進行化療藥物或卡介苗灌注治療能夠降低膀胱癌術后復發(fā)率，但是其術后五年復發(fā)率仍高達44.8%～55.8%，嚴重威脅著我國膀胱癌患者的生命健康[5]。因此研究有效降低膀胱癌術后復發(fā)的灌注新藥物已經(jīng)成為臨床上迫切需要解決的實際問題[6,7]。

隨著納米生物材料的研究進展，其在腫瘤治療上的應用得到了國內外學者的廣泛認可[8,9]。目前氧化鐵納米顆粒(Iron oxide nanoparticles,ION)已被美國藥品食品管理局(Food and drug administration,FDA)批準作為臨床用藥，用來進行核磁成像以及慢性腎病性貧血的治療[10]。然而ION是否對實體瘤有治療作用，目前尚未有文獻報道。ION經(jīng)靜脈注射后易被單核吞噬系統(tǒng)吞噬而富集于巨噬細胞，進而誘發(fā)巨噬細胞產生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，損傷周圍組織。該現(xiàn)象為腫瘤治療提供了新思路。本研究旨在探討ION是否可以通過誘導膀胱腫瘤內巨噬細胞產生ROS，進而抑制膀胱腫瘤的復發(fā)與生長，為ION發(fā)展為新型膀胱癌術后灌注藥物的可能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞及動物 小鼠非肌層浸潤性膀胱癌細胞系MB49購自中國科學院上海細胞庫；小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自ATCC；6周齡C57BL/6J雌性小鼠購自北京維通利華有限公司。

1.1.2實驗試劑 羧甲基葡聚糖包裹ION(西安瑞禧生物有限公司，中國)；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司，美國);CCK-8試劑盒、ROS試劑盒(碧云天公司，中國)；Calcein-AM/PI活細胞/死細胞雙染試劑盒(翊圣生物，中國)。

1.1.3主要儀器 熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；酶標儀(MK3型)、細胞培養(yǎng)箱、細胞超凈臺、離心機(Thermo公司，美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將MB49細胞和RAW264.7細胞接種于培養(yǎng)皿，用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置于37℃、CO2含量為5%的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，視細胞生長情況每2～3 d進行細胞傳代。

1.2.2ROS檢測及分組 將ION離心后棄上清溶解于完全培養(yǎng)基并超聲振蕩重懸，制備成濃度為3 mg/ml 的培養(yǎng)基，對照組為完全培養(yǎng)基。將1×104MB49接種于Transwell小室下室，將RAW264.7接種于Transwell小室上室，具體分組如下：MB49組；RAW264.7組；ION組；RAW264.7+MB49組；MB49+ION組；RAW264.7+ION組；RAW264.7+MB49+ION組。將7組細胞分別設置4個復孔，培養(yǎng)12 h后取培養(yǎng)基上清，離心后進行ROS試劑盒檢測。將RAW264.7培養(yǎng)于ION培養(yǎng)基中，實驗組放入去鐵胺(Desferrioxamine，DFO，400 μmol/ml)，培養(yǎng)12 h后取培養(yǎng)基上清，離心后進行ROS檢測。

1.2.3CCK-8檢測RAW264.7吞噬ION后對腫瘤細胞的抑制作用 將MB49接種于Transwell小室下室，將RAW264.7接種于Transwell小室上室，分別培養(yǎng)于ION培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基。具體分組如下：MB49組；MB49+RAW264.7組；MB49+RAW264.7+ION組；MB49+RAW264.7+ION+DFO組。培養(yǎng)12 h后，CCK-8檢測各組下室MB49增殖活性。并對各組進行Calcein-AM/PI染色，顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.2.4膀胱腫瘤種植模型 將40只C57BL/6J雌性小鼠隨機分成2組，每組20只。腹腔注射0.1%戊巴比妥麻醉后，用24G留置針經(jīng)尿道插入小鼠膀胱，建立通道。實驗組向膀胱內注射細胞數(shù)1×106、ION濃度為3 mg/ml的MB49細胞懸液0.1 ml;對照組僅注射相同細胞數(shù)的MB49 PBS懸液0.1 ml。夾閉留置針1 h后拔出，讓小鼠自行排尿。一周后將小鼠處死，檢測其膀胱癌成瘤率。

1.2.5膀胱癌皮下瘤模型的建立及瘤內注射治療 將12只C57BL/6J雌性小鼠隨機分成2組，每組6只。腹腔注射0.1%戊巴比妥麻醉后，在小鼠右肩部注射細胞數(shù)為1×106的0.1 ml MB49細胞懸液，建立小鼠皮下瘤膀胱癌模型。并每日用游標卡尺測量腫瘤大小，待腫瘤大小為100 mm3時，實驗組瘤內注射0.1 ml濃度為3 mg/ml 的ION懸液，對照組注射0.1 ml PBS，每5 d測量小鼠皮下瘤大小，并記錄。

2 結果

2.1ION誘導巨噬細胞產生ROS 巨噬細胞具有吞噬納米顆粒的特性，而腫瘤細胞在正常條件下吞噬能力較弱。圖1A為所購ION的透射電鏡圖片，ION平均直徑大小為30 nm。在相同濃度ION干預下，MB49直徑在ION培養(yǎng)下，ROS產量較少，而RAW264.7與ION可產生較多ROS,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而MB49+RAW264.7+ION組中ROS在所有實驗組中含量最高(P<0.01)，這可能是由于MB49在ROS作用下細胞發(fā)生損傷，釋放相關抗原，進一步刺激巨噬細胞活化導致[10]。(圖1B)。

2.2RAW264.7吞噬ION產生中的ROS可以被DFO抑制 為進一步研究INO釋放的鐵離子在ROS產生中的必要作用，我們用DFO清除培養(yǎng)基中的鐵離子。實驗組在RAW264.7與ION培養(yǎng)基中加入DFO后，如圖2A細胞培養(yǎng)基中的ROS明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3ION培養(yǎng)下RAW264.7能夠抑制MB49增殖并促進凋亡 如圖2B，CCK-8實驗表明，MB49在與RAW264.7和ION共培養(yǎng)下，增殖能力明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而MB49單獨與RAW264.7共培養(yǎng)組，增殖抑制差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Calcein-AM/PI染色檢測MB49共培養(yǎng)細胞死亡情況，如圖2C所示，MB49+RAW264.7+ION組相比MB49組與MB49+RAW264.7組細胞死亡數(shù)量明顯增加。而加入DFO后，隨著ROS的下降，MB49細胞死亡減少，說明鐵離子是ROS抑制MB49細胞增殖、促進細胞凋亡的必要因素。

圖1 RAW264.7吞噬ION后產生ROSFig.1 ION induces macrophage to produce ROSNote: A.Transmission electron microscope(TEM)of ION;B.Macrophage release ROS in different culturing situations.Compared with control group(MB49 alone)，#.P>0.05,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2 ROS抑制腫瘤活性Fig.2 ROS inhibits tumor cellsNote: A.DFO reduces ROS by eliminating iron;B.Cell viability of MB49 in different culturing situations;C.Calcein-AM/PI staining in different culturing situations.Compared with control group(MB49 alone)，#.P>0.05,*.P<0.05.

2.4ION能夠抑制MB49膀胱腫瘤種植 如圖3A，留置針經(jīng)尿道插入C57BL/6J雌性小鼠，成功建立膀胱腫瘤種植模型。實驗組(MB49+ION)成瘤率為10%(2/20)，對照組(MB49+PBS)成瘤率為90%(18/20)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ION能夠明顯抑制MB49對膀胱腫瘤的種植(圖3B)。

2.5瘤內注射能夠抑制MB49皮下瘤生長 在種瘤后第5天，小鼠皮下瘤大小約100 mm3，實驗組和對照組分別進行瘤內注射干預后，每5 d觀測腫瘤大小。如圖3C所示，實驗組腫瘤生長明顯受到抑制，結果表明瘤內注射能夠抑制MB49皮下瘤生長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 體內實驗驗證ION抑制膀胱癌Fig.3 ION inhibits bladder cancer in vivoNote: A.Establishment of cell implanting model;B.ION prevents bladder cancer cell implanting into bladder wall;C.ION inhibits tumor growth by intratumor injection.Compared with PBS group，*.P<0.05.

3 討論

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其中非肌層浸潤性膀胱癌約占膀胱癌總數(shù)的75%。對于非肌層浸潤性膀胱癌治療的金標準為經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術。但是膀胱癌術后極易復發(fā)，雖然臨床上患者術后常規(guī)膀胱灌注化療藥物或卡介苗來抑制腫瘤復發(fā)，但治療效果仍然不理想，術后5年復發(fā)率仍可高達44.8%～55.8%[5]。納米材料的興起為開發(fā)新型膀胱灌注藥物制劑提供了新的可能?，F(xiàn)階段國內外學者在預臨床研究中，通過優(yōu)化灌注藥物劑型在抑制膀胱癌的研究中取得了一定的成果。然而由于上述材料制備過于復雜，很難投入臨床使用[9]。因此尋找能夠快速進行臨床轉化的新型術后膀胱灌注藥物具有重要的臨床意義。ION已被FDA批準用于臨床成像及治療慢性腎病性貧血等疾病，但目前尚無ION直接抑制腫瘤的臨床報道。Zanganeh等[10]于2016年報道了將乳腺癌細胞與ION共同注射到小鼠乳腺中可以使小鼠乳腺癌延遲生長，并且可以抑制腫瘤的遠處轉移。這一研究首次提出了ION可能具有潛在的抗瘤作用，但是并沒有證明ION對已生長出的腫瘤具有抑制作用。因此研究并證實ION對于阻止膀胱癌細胞再種植以及抑制小癌灶具有重要意義，能夠為ION作為新型膀胱灌注藥物提供預臨床的理論依據(jù)。

本研究通過體內實驗驗證ION在細胞水平通過誘導巨噬細胞產生ROS抑制腫瘤活性，促進腫瘤的死亡。同時在體內實驗證實了其抑制腫瘤的確切效果。巨噬細胞作為固有免疫防線的重要細胞之一，具有強大的吞噬功能。大量文獻指出，納米顆?？梢员痪奘杉毎淌?，而ION被吞噬后可以釋放Fe2+，巨噬細胞中的H2O2可以與Fe2+通過芬頓反應生成OH·釋放到細胞外，作為強氧自由基殺傷腫瘤細胞。而用DFO將游離的Fe2+通過絡合反應去除后，巨噬細胞產生的氧自由基明顯下降，這與我們的實驗結果吻合。

本研究進一步通過兩種動物模型模擬膀胱癌復發(fā)的兩種主要因素，即游離腫瘤細胞再種植和術后殘余灶。兩種動物模型實驗結果表明，ION能夠降低膀胱癌細胞種植于膀胱內壁，降低原位癌模型成瘤率；同時能夠抑制腫瘤的生長，具有良好的抗瘤作用。

綜上所述，ION可以通過巨噬細胞產生殺傷膀胱癌細胞的ROS自由基，能夠抑制腫瘤細胞在膀胱壁的種植以及小腫瘤的生長，本研究為ION作為新型膀胱灌注制劑提供了預臨床理論依據(jù)，其是否可以作為新型膀胱灌注藥物有待臨床研究進一步證實。