基于TLR4/NF-κB信號通路探討通痹膠囊對膠原誘導型關節(jié)炎治療機制的研究①

李宗祥 肖 凱

(華中農業(yè)大學醫(yī)院，武漢430070)

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以小關節(jié)為主的慢性關節(jié)滑膜炎癥、關節(jié)軟骨和骨組織損傷的自身免疫性疾病，最終引起關節(jié)畸形和功能障礙，是使患者喪失勞動力和致殘的疾病之一，給患者及其家庭帶來極大的痛苦和負擔[1-3]。在RA的發(fā)展過程中，抗炎因子和促炎因子的平衡是影響患者自身免疫、炎性反應和關節(jié)損傷的關鍵因素。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)是一類廣泛表達于不同組織和細胞中的模式識別受體，不僅可以通過識別病原相關分子模式激活天然免疫，還可以通過刺激抗原呈遞細胞分泌炎癥因子調節(jié)獲得性免疫[4,5]。髓樣分化因子88(MyD88)依賴型TLR信號轉導途徑可以通過激活轉化生長因子β(Transformation growth factor β，TGF-β)和核因子κB(NF-κB)誘導細胞炎癥因子白介素-1(Interleukin-1，IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、黏附分子以及干擾素的表達和釋放，加重對組織器官的損傷[6-8]。復方通痹膠囊為臨床常見的中藥復方制劑，有消腫止痛和祛風除濕的作用，廣泛應用于風濕以及RA的治療，但其作用機制的研究仍相對缺乏[9,10]。目前根據(jù)造模物質的不同，常見的RA模型有佐劑誘導型關節(jié)炎模型(Adjuvant-induced arthritis，AA)、膠原誘導型關節(jié)炎(Collagen-induced arthritis，CIA)和膠原抗體誘導型關節(jié)炎(Collagen antibody induced arthritis，CAIA)。其中CIA模型的組織和免疫學特征與人類RA的最接近，因此CIA模型廣泛用于RA的相關研究中。因此，為了進一步闡明通痹膠囊在RA中的治療機制，本研究通過建立CIA模型，探究TLR4通路在通痹膠囊治療RA中的作用機制，為其臨床治療RA提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性Spraque-Dawley大鼠64只，體重(200±20)g，SPF級，購自湖北省實驗動物研究中心。所有大鼠在實驗室適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。飼養(yǎng)條件為固定光照(12 h∶12 h/白天∶黑夜)，溫度(24±2)℃，濕度約30%，自由飲水和進食。

1.1.2實驗試劑 通痹膠囊由華中農業(yè)大學醫(yī)院提供，批號：Z10960010。牛Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ,C Ⅱ)、完全弗氏佐劑(Complete fereund′s adjuvant，CFA)、雷公藤購自Sigma公司。4%多聚甲醛和蘇木精-伊紅染液購自北京艾德萊生物科技有限公司。BCA試劑盒購自ThermoFisher公司。大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TLR4(ab13556)、MyD88(ab2064)、NF-κB(ab131546)抗體購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 實驗動物適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(Con，8只)和CIA模型組(40只)。將4 g/L的CⅡ型膠原和等量CFA混合均勻并使用均漿器乳化，將制備好的乳劑置于4℃保存?zhèn)溆谩IA模型動物分3點皮內注射CⅡ/CFA乳劑，即背部靠近尾部左右2點分別注射0.2 ml，尾根部注射0.1 ml。7 d后采用同樣方法皮下注射0.1 ml CⅡ/CFA乳劑1次。正常對照組動物在相同部位等時間點注射等體積生理鹽水。

1.2.2實驗動物分組及處理 取造模14 d后成功的大鼠40只，隨機分為模型組(Mod)、陽性對照組(雷公藤處理，PC組，0.01 g/kg)、通痹膠囊0.075、0.150、0.300 g/kg劑量組(LD、MD、HD組)。每組8只。處理組以1 ml給藥體積/100 g體重灌胃相應藥品，每天1次，連續(xù)給藥14 d。對照組和模型組灌胃相應體積的生理鹽水。治療結束后使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，取關節(jié)滑膜組織至EP管中保存于-80℃?zhèn)溆茫蝗￡P節(jié)組織固定于4%多聚甲醛溶液中備用。

1.2.3關節(jié)腫脹度檢測 使用大鼠足踝體積測量儀利用排水法檢測大鼠雙后足踝體積變化，整個實驗過程每7 d測量1次。采用同側足踝造模前后體積差值為關節(jié)腫脹度。

1.2.4HE染色觀察關節(jié)病理變化 將大鼠關節(jié)組織從4%多聚甲醛溶液中取出，并使用梯度濃度乙醇脫水，然后使用二甲苯透明、石蠟包埋、切片；隨后使用二甲苯對切片進行脫蠟處理，蘇木精染色、1%鹽酸、乙醇分化20 s，流水沖洗2 min后使用0.5%伊紅染液染色，梯度乙醇脫水透明，封片，普通光學顯微鏡下觀察分析。

1.2.5ELISA檢測大鼠血液炎癥因子水平 使用尾靜脈采血方法采取大鼠血液，4℃靜置過夜后，3 500 r/min 離心5 min，取血清檢測炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.6Western blot檢測大鼠關節(jié)滑膜組織中TLR4/NF-κB通路相關蛋白的表達水平 取50 mg滑膜組織于2 ml EP管中并加入1 ml含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液以及2粒玻璃珠，勻漿器勻漿5 min。4℃下12 000 r/min離心15 min，取上清并用BCA蛋白檢測試劑盒進行定量。每組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，檢測TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達情況，以GAPDH作為定量分子標記物，使用BandScan 5.0軟件進行圖像分析。

1.2.7回補實驗 16只SD大鼠隨機分為正常組(Con)、模型組(Mod)、0.300 g/kg通痹膠囊治療組(Hig)、通痹膠囊聯(lián)合TLR4激動劑處理組(單磷酰脂質A，Monophosphoryl lipid A，MPLA，HIG+MPLA)，每組4只。實驗動物造模以及處理方式參考1.2.1與1.2.2。處理后檢測血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平和滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達情況。

2 結果

2.1通痹膠囊對大鼠關節(jié)腫脹度的影響 采用排水法對各組大鼠關節(jié)腫脹度進行檢測，結果如圖1所示。與正常對照組相比，模型組、陽性對照組和通痹膠囊各劑量組大鼠關節(jié)腫脹度均顯著升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，陽性對照組和通痹膠囊高劑量組治療7 d和14 d后的關節(jié)腫脹度顯著降低(P<0.05)。

2.2通痹膠囊對模型大鼠關節(jié)病理的影響 如圖2所示，正常對照組大鼠可見滑膜細胞排列整齊且無增生，血管分散分布，關節(jié)腔無滲出物，無浸潤的單核和淋巴細胞，關節(jié)表面光滑。模型組滑膜組織增生明顯，炎癥細胞浸潤，組織內可見新生毛細血管增多以及散在分布的尚未形成管腔結構的毛細血管，形成關節(jié)軟骨的破壞。陽性對照組和通痹膠囊高、中劑量用藥組治療后不同程度地抑制了滑膜組織的增生，降低炎癥細胞的浸潤。

圖1 大鼠關節(jié)腫脹度變化Fig.1 Changes of joint swelling in ratNote: Mean SD.n=6.*.P<0.05 vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

圖2 HE染色觀察大鼠關節(jié)組織病理變化Fig.2 Observation of histological changes of rat arthritis tissues by HE stainingNote: A.Control group;B.CIA model group;C.Positive control group;D.Tongbi capsule low dose group;E.Tongbi capsule middle dose group;F.Tongbi capsule high dose group.Arrow.Damage in cartilage;oval.damage in synovial.

2.3通痹膠囊對模型大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平影響 各組大鼠處理后血清炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平如圖3所示。與正常對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和通痹膠囊高劑量組血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。實驗結果表明0.3 g/kg通痹膠囊處理14 d能顯著降低CIA大鼠血清炎癥因子的水平，從而降低炎性反應水平。

2.4通痹膠囊對模型大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達影響 本研究使用Western blot檢測各組大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表達情況，結果如圖4所示。與正常對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB水平均顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，陽性對照組和通痹膠囊中、高劑量組滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB水平顯著降低(P<0.05)，且陽性對照組顯著低于通痹膠囊處理組。

2.5激活TLR4/MyD88信號通路可以抑制通痹膠囊對CIA大鼠的治療作用 為了驗證通痹膠囊可以通過抑制TLR4/MyD88信號通路發(fā)揮對CIA的治療作用，本研究使用通痹膠囊聯(lián)合TLR4/MyD88激動劑MPLA處理CIA大鼠。結果發(fā)現(xiàn)，MPLA處理后顯著降低通痹膠囊對TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達的抑制作用，提高TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表達水平，見圖5。且激活TLR4/MyD88通路以后大鼠血清炎癥因子IL-6、 IL-1β、 TNF-α水平顯著高于通痹膠囊單獨處理組，見圖6，說明通痹膠囊可以通過抑制TLR4/MyD88信號通路治療RA。

圖3 大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平變化Fig.3 Levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat serumNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;PC.Positive control group;LD.Tongbi capsule low dose group;MD.Tongbi capsule middle dose group;HD.Tongbi capsule high dose vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

圖4 大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達水平Fig.4 Protein levels of TLR4，MyD88 and NF-κB in rat synovial tissuesNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;PC.Positive control group;LD.Tongbi capsule low dose group;MD.Tongbi capsule middle dose group;HD.Tongbi capsule high dose vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

圖5 抑制TLR4通路對大鼠滑膜組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of protein expression of TLR4，MyD88 and NF-κB in rat synovial tissues by inhibited TLR4 pathwayNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;HD.Tongbi capsule high dose group;HIG+MPLA.Tongbi capsule high dose combine with TLR4 agonist vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs HIG group.

圖6 抑制TLR4通路對大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平影響Fig.6 Effect of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat by inhibited TLR4 pathwayNote: CON:control group;MOD:CIA model group;HD:Tongbi capsule high dose group;HIG+MPLA:Tongbi capsule high dose combine with TLR4 agonist vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs HIG group.

3 討論

RA是一種致病機制較為復雜且難以治愈的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制尚未完全明確，因此至今尚無特效療法[11]。疼痛和炎癥是RA的兩大主要癥狀，現(xiàn)行RA的治療也是通過減輕關節(jié)組織的炎性反應，達到修復關節(jié)損傷、降低痛疼、緩解癥狀的目的[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，通痹膠囊能夠通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕膠原誘導的大鼠關節(jié)組織損傷，以及降低大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

RA患者病灶局部發(fā)生T細胞浸潤，大量分泌IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子。IL-1β可以通過刺激淋巴細胞釋放細胞因子，刺激滑膜細胞和軟骨細胞釋放金屬蛋白酶和機制溶素，破壞軟骨基質[13]。IL-6作為一種促炎因子可以通過增加IL-1β和TNF-α的一些生物效應的放大因子，誘導肝臟合成類風濕因子[14]。RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，是由于風、寒、濕和熱等外邪侵襲人體導致的麻木、屈伸不利和關節(jié)腫大等癥狀。通痹膠囊具有解表除濕、祛風散寒、活血化瘀、抗炎和鎮(zhèn)痛的作用[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，0.300 g/kg通痹膠囊治療14 d后大鼠關節(jié)滑膜組織損傷顯著減輕，且炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平也顯著降低，說明通痹膠囊能夠顯著抑制CIA大鼠的炎性反應，減輕炎癥損傷。吳德松等[16]研究也證實通痹膠囊具有明顯的鎮(zhèn)痛以及抗RA活性。王曉磊等[9]在治療RA的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)通痹膠囊對于改善RA患者的關節(jié)功能具有良好療效，且能夠顯著降低患者外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

TLR是一類啟動天然免疫的細胞表面信號傳導受體蛋白，在自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用。TLR4是天然免疫系統(tǒng)識別病原體的主要受體，廣泛表達于上皮細胞、內皮細胞以及免疫細胞表面，與慢性炎癥、自身免疫疾病以及腫瘤的發(fā)生相關。TLR4可以通過MyD88依賴和MyD88非依賴信號轉導途徑激活細胞內信號轉導，誘導NF-κB活化，從而活化炎性反應，引起IL-6、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的釋放，誘導級聯(lián)炎性反應[17]。本研究結果顯示，通痹膠囊治療后大鼠關節(jié)組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平顯著降低，說明通痹膠囊顯著抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而抑制炎癥因子的釋放，改善RA癥狀[18]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)激活TLR4/NF-κB信號通路以后能夠顯著抑制通痹膠囊誘導的炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低。

綜上所述，本研究以膠原誘導型RA模型為基礎，通過病理學觀察和免疫學檢測，證實通痹膠囊可以通過抑制TLR4/NF-κB通路的異常激活，降低炎癥因子的釋放，顯著改善RA的炎性反應。