雷公藤內(nèi)酯醇抑制IL-17/TNF-α調(diào)節(jié)造血干細胞移植后特發(fā)性肺炎綜合征①

徐小麗 陳焯文 鄒 萍

(佛山市第一人民醫(yī)院血液科，佛山528000)

異基因造血干細胞移植(Allogeneic hematopoi-etic stem cell transplantation,Allo-HSCT)是目前治愈急性白血病、再生障礙性貧血等血液系統(tǒng)疾病的最有效手段[1,2]，但急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)限制了造血干細胞移植的預(yù)后[3,4]。肺是aGVHD的重要潛在靶器官，造血干細胞移植后可出現(xiàn)致死性肺aGVHD，表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難，肺功能異常，肺部出現(xiàn)間質(zhì)性病變及肺泡損傷，組織中有大量淋巴細胞浸潤，一旦出現(xiàn)將嚴重影響患者的生命安全及生活質(zhì)量[5]。目前預(yù)防aGVHD常用的免疫抑制劑為環(huán)孢素、他克莫司等[6]，但其長期使用不良反應(yīng)大、費用高，因此，尋找較小副作用的新型免疫抑制劑，有效改善移植后嚴重并發(fā)癥，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重要方向。

雷公藤內(nèi)酯醇(又稱雷公藤甲素，Triptolide，TPL)是從衛(wèi)矛科雷公藤植物中分離出來的含有 3 個環(huán)氧基的二萜內(nèi)酯化合物，其分子量為360.4，分子式為C20H24O6，它具有抑制多種炎癥因子的生成及免疫細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等抗炎和抗腫瘤等作用[7,8]，被認為是器官移植領(lǐng)域中一種很有前景的藥物[9]。本研究將其用于小鼠肺aGVHD模型，觀察肺組織病理及炎癥因子變化，以評價其對肺部aGVHD的防治效果及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6～8周齡的清潔級雄性近交系純種C57BL/6小鼠和無特定病原體級(SPF)純種雌性BALB/c小鼠(體重18.5～22.0 g)，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；蘇木素、醇性伊紅購于武漢博士德生物工程有限公司；慶大霉素注射液和紅霉素片購于廣州白云山制藥股份有限公司；小鼠IFN-γ、IL-17、IL-2的ELISA試劑盒購于美國R&D Systems公司；小鼠TNF-α ELISA試劑盒購于美國圣地亞哥的eBioscience公司。雙向通風(fēng)超凈臺購于蘇州凈化有限公司；光學(xué)顯微鏡和BX50WI型顯微攝影系統(tǒng)購于日本Olympus公司；微量加樣器購于德國Eppendoff公司；直線加速器購于德國西門子公司。

1.2方法

1.2.1受鼠的準(zhǔn)備 實驗受鼠均飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心的SPF級實驗室中，采用分籠方式飼養(yǎng)，于移植前1周開始飲用含慶大霉素和紅霉素滅菌水；預(yù)處理采用直線加速器行全身照射(TBI)，總劑量共為13.0 Gy，為減少受鼠的腸道毒性，總劑量分2次照射，每隔3 h照射1次，照射量率為2.0 Gy/min，照射距離為100 cm。

1.2.2aGVHD模型建立及實驗分組 采用麻醉后頸椎脫臼法處死供鼠，乙醇浸泡消毒，無菌操作臺下無菌摘取脾臟，充分研磨過濾，收集單個細胞懸液。分離供鼠的股骨，去除兩端骨骺暴露骨髓，以1 ml注射器反復(fù)沖洗骨髓腔至發(fā)白為止，過濾收集細胞液；將上述兩種細胞液收集后1 200 r/min離心5 min，裂解紅細胞，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，調(diào)整骨髓細胞和脾細胞比例為1∶4 以誘導(dǎo)出現(xiàn)肺部aGVHD。受鼠在TBI預(yù)處理結(jié)束的4 h內(nèi)經(jīng)其尾靜脈輸注移植物。實驗分組為： C57BL/6小鼠→C57BL/6小鼠，同基因移植組；C57BL/6J→BALB/c，PBS組；C57BL/6J→BALB/c，TPL組，后兩組分別指于移植后d0～d7予磷酸鹽緩沖液或雷公藤內(nèi)酯醇液[1 mg/(kg·d)]胃內(nèi)灌服處理移植后受鼠。

1.2.3aGVHD監(jiān)測 觀察移植小鼠的體重、活動度及弓背、聳毛、腹瀉、皮膚脫毛或潰瘍等表現(xiàn)，按Cooke的評分系統(tǒng)進行aGVHD評分[10]。

1.2.4存活時間觀察 觀察移植小鼠是否存活直至移植后d42，繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.2.5組織病理學(xué)檢測 當(dāng)移植后受鼠的aGVHD評分≥8分或存活超過42 d，靜脈麻醉小鼠后采取仰臥位，逐層分離頸部組織，暴露出氣管，用18G套管針插入氣管上端，去除針芯，用絲線經(jīng)氣管食管間隙綁扎氣管及套管針，使其固定并密封，用質(zhì)量濃度為40 g/L 的多聚甲醛反復(fù)灌注沖洗直至肺組織發(fā)白為止，后摘取小鼠的肺組織，多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變，按Delisle標(biāo)準(zhǔn)對肺組織進行組織學(xué)半定量評分[9]。隨機取同基因移植組受鼠的肺組織為同型對照。

1.2.6肺組織中細胞因子水平 取100 mg肺組織剪碎，加入100 μl PBS充分勻漿，以1 200 r/min離心5 min，吸取上清液，-80℃保存，將樣本加入酶標(biāo)孔，37℃下孵育2 h，加生物素標(biāo)記的IFN-γ、IL-17、IL-2和TNF-α抗體孵育60 min，洗板并甩干，加顯色液，37℃下孵育60 min，洗板并甩干，加入底物避光顯色，用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定小鼠肺組織中IFN-γ、IL-17、IL-2和TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1aGVHD臨床表現(xiàn)和生存期 同基因移植組受鼠因全身放療預(yù)處理其食欲下降，在移植第 1周出現(xiàn)短時間體重下降，于2周后體重開始恢復(fù)，移植d42小鼠全部存活，受鼠均無弓背、聳毛、脫毛、皮膚潰瘍、腹瀉、發(fā)熱、呼吸困難等aGVHD表現(xiàn)；PBS處理的MHC完全不相合移植小鼠組1周內(nèi)出現(xiàn)重度精神萎靡、聳背、豎毛、毛發(fā)脫落、腹瀉、血便甚至脫肛，小鼠出現(xiàn)呼吸困難、氣促，其aGVHD臨床評分在移植后1周明顯升高(6.6±0.64)，而后繼續(xù)升高至小鼠瀕死，于移植后d21內(nèi)小鼠全部死亡；雷公藤內(nèi)酯醇處理的移植受鼠可出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、呼吸稍促等表現(xiàn)，較PBS處理組其癥狀明顯改善，于移植后第2周小鼠出現(xiàn)死亡，d42總生存率為50%(圖1A為小鼠生存曲線；圖1B為小鼠的aGVHD臨床評分)。

圖1 受鼠生存率及aGVHD臨床評分Fig.1 Survival rate and aGVHD clinical scoreNote: A.Survival for syngeneic,phosphate buffer saline(PBS) and triptolide group；B.Animals were monitored weekly for aGVHD clinical scores.In histograms,data represent the mean and SD.*.P<0.05，**.P<0.01,compared with syngeneic and allogeneic groups.

圖2 各組造血干細胞移植術(shù)后肺組織病理切片(HE，×200)Fig.2 Pathophysiology of lung injury after hematopoietic stem cell transplantation among different groups(HE,×200)

2.2組織病理學(xué)改變 當(dāng)小鼠aGVHD臨床評分>8分或小鼠瀕死時，經(jīng)支氣管灌洗固定肺組織，HE染色檢測不同組小鼠肺的病理變化。同基因受鼠胸膜腔中未見胸水，肺組織中見少量淋巴細胞，肺泡出血少見； PBS處理組受鼠的肺組織可見大量炎癥細胞浸潤，血管壁腫脹明顯、大量紅細胞滲出，肺泡之間間隔變寬及破壞，不少肺組織可見纖維蛋白滲出；雷公藤內(nèi)酯醇處理組受鼠的肺組織可見炎癥細胞浸潤，少量紅細胞滲出，支氣管炎性增生，但程度較PBS處理組明顯改善(圖2)。

2.3肺組織中細胞因子水平 完全不相合小鼠造血干細胞移植后可出現(xiàn)致死性GVHD改變，PBS處理組小鼠肺組織可出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，肺泡出血、組織壞死、纖維蛋白滲出，而雷公藤內(nèi)酯醇處理組肺損傷明顯減輕。為了初步探索雷公藤內(nèi)酯醇在異基因造血干細胞移植肺組織的免疫保護機制，實驗對比了不同肺組織IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-2的水平。結(jié)果顯示，雷公藤內(nèi)酯醇處理組，在第1～3周其IL-2水平均未見明顯變化(P>0.05)，其肺組織中IFN-γ水平亦未見明顯變化(P>0.05)，在第4周PBS處理組受鼠均已死亡，無法獲得此時期該組肺組織的IFN-γ水平；在第1周，雷公藤內(nèi)酯醇處理組肺組織的IL-17與PBS組未見顯著性差異，而第2周，經(jīng)雷公藤內(nèi)酯醇處理組其IL-17明顯下降[TPL(19.2±3.7)pg/ml vs PBS(37.1±4.3)pg/ml，P<0.05]，在第3周其下降程度更顯著[(14.7±5.1)pg/ml vs (56.7±1.1)pg/ml]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；進一步對比了TNF-α在肺組織中的差異，于移植后第1周，經(jīng)雷公藤內(nèi)酯醇處理組TNF-α無明顯變化；而第2周，雷公藤內(nèi)酯醇處理組的TNF-α明顯下降[TPL(192.7±5.7)pg/ml vs PBS(327.6±11.5)pg/ml，P<0.05]，在第3周，TNF-α下降更顯著[(87.1±4.4)pg/ml vs (369.4±15.1)pg/ml，P<0.05](圖3)。

圖3 各組造血干細胞移植組肺中IFN-γ、IL-17、TNF-α和 IL-2水平(pg/ml)Fig.3 IFN-γ,IL-17,TNF-α and IL-2 determined in lung by ELISA(pg/ml)

3 討論

異基因造血干細胞移植是治愈血液系統(tǒng)疾病的重要手段，肺部并發(fā)癥是影響患者療效的主要因素[11]。廣譜抗生素及抗病毒藥物的預(yù)防性使用，造血干細胞移植術(shù)后肺部感染因素所占比重下降，非感染性肺部并發(fā)癥發(fā)病率越來越高。肺為aGVHD的常見靶器官，發(fā)生在100 d內(nèi)的和免疫相關(guān)的肺部并發(fā)癥稱為特發(fā)性肺炎綜合征(Idiopathic pneumonia syndrome,IPS)，是指包括間質(zhì)性肺炎、閉塞性細支氣管炎、閉塞性細支氣管炎伴機化性肺炎、彌漫性肺泡出血、圍植入期呼吸窘迫綜合征、非心源性毛細血管滲漏綜合征、遲發(fā)性肺毒性綜合征和肺細胞溶解性血栓等，臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽，明顯的呼吸困難、有或無發(fā)熱、低氧血癥及肺部彌漫性間質(zhì)浸潤[12,13]。肺aGVHD一旦發(fā)生，病情多進展迅速，預(yù)后差，死亡率高達50%～74%，無特效的治療方案[14,15]。

肺aGVHD的發(fā)病機制尚不清楚[16]，現(xiàn)認為造血干細胞移植后肺組織損害與局部組織中T細胞分泌的細胞因子相關(guān)[17]，其相關(guān)的危險因素包括全身照射(TBI)或化療對組織的損傷，同種異體T細胞的活化和大量的炎性因子產(chǎn)生。目前，“肝-腸-肺”炎性細胞因子軸在IPS中的重要作用越來越受到人們的重視[18]。大劑量放化療預(yù)處理可削弱腸道的黏膜屏障，促進大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素-脂多糖(LPS)，同時放化療預(yù)處理還可使受者組織釋放炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-1等，而這些炎癥介質(zhì)可促進受者抗原提呈細胞(MHC)提呈抗原于供者T細胞，并進而激活T細胞，活化后T細胞可向不同T細胞亞群分化，最終釋放出相關(guān)炎癥因子如IFN-γ、IL-2和IL-17等，它們可減弱或促進IPS發(fā)生。特發(fā)性肺炎綜合征在臨床上并不常發(fā)生，肺屬于aGVHD的非經(jīng)典靶器官，在實驗中采用C57BL/6J→BALB/c完全不相合移植模型，移植物中骨髓細胞和脾細胞比例為1∶4，最終誘導(dǎo)出現(xiàn)致死性肺部aGVHD改變，3周內(nèi)受者全部死亡，證實在特定條件下肺可發(fā)生致死性特發(fā)性肺炎綜合征，與前期研究相一致[19]。進一步研究表明，受者組織損害釋放的IFN-γ可激活供者巨噬細胞趨化至肺組織，在LPS刺激作用下可分泌如TNF-α等炎癥因子，使炎性細胞趨化至肺組織，最終導(dǎo)致肺組織損傷。而IL-2可刺激供者T細胞的增殖和分化，活化、分化的Th1、Th2、Th17細胞趨化至肺組織，減輕或加劇肺損傷。由此可見，肺組織中細胞因子與造血干細胞移植后特發(fā)性肺炎綜合征的發(fā)生有重要關(guān)系，因此，實驗檢測了造血干細胞移植術(shù)后肺組織局部中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17水平。在實驗中觀察到造血干細胞移植后IFN-γ有2個峰值，前者為移植預(yù)處理損傷機體組織釋放，后者為供者T細胞免疫活化向細胞亞群分化并釋放所致，在實驗后期，IPS的發(fā)生與IL-2、IL-17和TNF-α顯著升高有關(guān)，這與前期研究有一致性[19]，已有研究表明TNF-α可通過提高肺血管內(nèi)皮細胞凋亡而促進IPS發(fā)生，阻斷TNF-α可顯著減輕IPS的嚴重程度。Mauermann等[20]證實產(chǎn)IL-17的Th17細胞在特發(fā)性肺炎綜合征中發(fā)揮重要作用，阻斷IL-17或聯(lián)合阻斷TNF-α，可能對治療特發(fā)性肺炎綜合征有重要價值。因此，尋求一種低毒、有效并可抑制相關(guān)炎癥介質(zhì)的新型免疫抑制劑對指導(dǎo)治療肺部aGVHD有重要意義。

雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide，TPL)，是從雷公藤中分離出來的二萜內(nèi)酯化合物，在體內(nèi)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易獲得，其生理活性強，具有抑制多種炎癥因子生成及免疫細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡等作用[21]。雷公藤內(nèi)酯醇在外周血單個核細胞及小鼠哮喘模型中直接抑制不同細胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ和TNF-α的釋放[22,23]，Wang[24]和Ying等[25]發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇可有效阻止 T 細胞增殖和活化而抑制Th17細胞產(chǎn)生因子IL-17。在小鼠骨髓移植模型中,雷公藤內(nèi)酯醇可顯著改善aGVHD發(fā)生，其機制與體內(nèi)脾單核細胞顯著減少、CD8+T 細胞增加、D4+T 細胞減少和活化的IL-2受體增加相關(guān)[26]。實驗采用雷公藤內(nèi)酯醇處理造血干細胞移植受者，分別檢測肺組織局部IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17水平，實驗發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇明顯改善移植小鼠生存時間和臨床表現(xiàn)，可明顯改善毛細血管通透性、紅細胞滲出和水腫，伴隨著肺組織中IL-17和TNF-α水平明顯下降，隨著時間延長，雷公藤內(nèi)酯醇的抑制作用更為明顯。實驗中經(jīng)雷公藤內(nèi)酯醇處理的肺組織其IL-2水平未見明顯變化，可能與雷公藤內(nèi)酯醇明顯抑制IL-2受體表達，但對IL-2的產(chǎn)生水平無影響相關(guān)，其抑制淋巴細胞增殖是通過影響IL-2和IL-2R相互作用發(fā)揮的[27]。

綜上所述，異基因造血干細胞移植后可發(fā)生致死性特發(fā)性肺炎綜合征，雷公藤內(nèi)酯醇可明顯改善其發(fā)生及進展程度，其免疫機制與降低肺組織內(nèi)細胞因子IL-17和TNF-α水平相關(guān)。但雷公藤內(nèi)酯醇如何影響肺組織內(nèi)細胞亞群分布、如何抑制不同細胞因子來調(diào)節(jié)特發(fā)性肺炎綜合征的發(fā)生和進展等尚需要深入研究。