血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平與骨肉瘤臨床病理及預(yù)后的關(guān)系探討

梁一民 潘寒松

[摘要] 目的 探討血清miR-19a與基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達(dá)水平與骨肉瘤臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。 方法 選擇2016年1月～2017年6月間我院收治的骨肉瘤患者81例作為研究對象，設(shè)為骨肉瘤組，同期選取在我院體檢的健康人群35例作為對照組。比較兩組受試者的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平變化情況，分析骨肉瘤患者血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，術(shù)后隨訪12個月，比較復(fù)發(fā)者和未復(fù)發(fā)者血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平變化情況。 結(jié)果 骨肉瘤組患者的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平與骨肉瘤患者的年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P>0.05）;但TNM分期Ⅱb/Ⅲ者高于Ⅱa分期者，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高于未轉(zhuǎn)移者，術(shù)后隨訪12個月，復(fù)發(fā)組的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平均高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 骨肉瘤患者血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平明顯升高，其可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，術(shù)后對其檢測在骨肉瘤患者的預(yù)后判斷中具有一定價值。

[關(guān)鍵詞] 血清;miR-19a;MMP-9;臨床病理;預(yù)后判斷

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）16-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum miR-19a and matrix metalloproteinase-9（MMP-9） expression levels and clinicopathology and prognosis of osteosarcoma. Methods 81 patients with osteosarcoma who were admitted to our hospital from January 2016 to June 2017 were selected as the study subjects and were assigned to the osteosarcoma group. In the same period， 35 healthy people who received physical examination in our hospital were selected as the control group. The changes of serum miR-19a and MMP-9 expression levels in the two groups were compared. The relationship between serum miR-19a and MMP-9 expression levels and clinical pathological parameters in the patients with osteosarcoma was analyzed. The follow-up was carried out for 12 months after surgery to compare the changes of serum miR-19a and MMP-9 expression levels between the patients with recurrence and the ones without recurrence. Results The serum levels of miR-19a and MMP-9 in the osteosarcoma group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. There was no significant correlation between serum miR-19a and MMP-9 expression levels and age， gender and tumor size of osteosarcoma patients（P>0.05）; however， those with TNM stage Ⅱb/Ⅲ were higher than those with stage Ⅱa， and those with distant metastasis were higher than those without metastasis. After 12 months of postoperative follow-up， the expression levels of serum miR-19a and MMP-9 in the recurrent group were higher than those in the non-recurrent group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The expression levels of serum miR-19a and MMP-9 in osteosarcoma patients are significantly increased， which may be involved in the occurrence and development of osteosarcoma， and their postoperative determination has a certain value in the prognosis of patients with osteosarcoma.

[Key words] Serum; miR-19a; MMP-9; Clinical pathology; Prognosis judgement

骨肉瘤是臨床上常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于10～25歲的兒童和青少年，具有高惡性度和強侵襲性等特點，是導(dǎo)致青少年致殘和致死的重要原因[1]。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計表明，1/5的患者確診時已轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[2]。目前，臨床上骨肉瘤的治療主要以手術(shù)和化療為主，但研究顯示，患者的5年生存率僅為20%左右，而腫瘤轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是影響患者治療效果和生存率的重要因素[3]。MMP-9為機體的一種蛋白水解酶，具有促進(jìn)瘤內(nèi)血管生成的作用。研究顯示，其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。近年來，miR已成為腫瘤研究的熱點，目前已發(fā)現(xiàn)的miR多達(dá)上千種，在不同腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了不同miR的特異性表達(dá)。研究表明，miR-19a在肝癌及癌旁組織中呈差異化表達(dá)[5]，在胃癌和健康人群中也呈差異化表達(dá)。還有研究表明，miR-19a與骨肉瘤患者的預(yù)后關(guān)系密切[6]。本研究通過觀察健康人群和骨肉瘤患者的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)變化情況，并分析其與骨肉瘤患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系，旨在為骨肉瘤的臨床診治提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2016年1月～2017年6月間我院收治的行骨肉瘤根治切除術(shù)患者81例作為研究對象，設(shè)為骨肉瘤組，患者均符合《骨肉瘤臨床循證診療指南》[7]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)X線、病理檢查確診。同期選取在我院體檢的健康人群35例作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，且入院前未接受手術(shù)和（或）抗腫瘤治療者;②初次發(fā)病者;③知情、自愿參與本研究者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院前曾接受手術(shù)或抗腫瘤治療者;②臨床資料不完整者;③妊娠或哺乳期婦女;④精神疾病者;⑤合并其他腫瘤者。對照組中，男19例，女16例，年齡13～25歲，平均（19.52±3.46）歲。骨肉瘤組中男43例，女38例，年齡13～24歲，平均（19.79±3.65）歲，TNM分期Ⅱa期49例，Ⅱb/Ⅲ期32例。本研究得到兩組受試者簽署知情同意書，并得到我院倫理委員會核準(zhǔn)。兩組受試者的基本資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2檢測方法

兩組受試者均于入院第2天（對照組為體檢當(dāng)天）清晨空腹外周靜脈采集血液標(biāo)本5 mL，醫(yī)用離心機3000 r/min，離心15 min，分離血清，保存于-60℃冰箱待測。miR-19a采用實時熒光定量PCR進(jìn)行檢測，用miRNeasy提取試劑盒提取血清中的miRNA，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（cDNA），qRT-PCR的條件如下：95℃ 5 min，95℃15 s，60℃ 1 min，總共40個循環(huán)。將溶解度曲線溫度設(shè)定為60℃～95℃，每個樣品重復(fù)測定3次，取平均值。采用2-△△Ct法計算血清中的miR-19a水平。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中MMP-9水平，測量3次取平均值。miRNeasy提取試劑盒購自QIAGEN公司，ELISA試劑盒購自上海一研生物科技有限公司，所有檢測均嚴(yán)格按照試劑盒及儀器說明書進(jìn)行操作。

骨肉瘤組患者于術(shù)后1個月再次清晨空腹外周靜脈采集血液標(biāo)本5 mL，采用上述方法檢測miR-19a與MMP-9表達(dá)水平，并隨訪12個月，統(tǒng)計復(fù)發(fā)況。

1.3觀察指標(biāo)

觀察兩組受試者的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平變化情況，以及與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，術(shù)后隨訪12個月，比較復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平變化情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，miR-19a與MMP-9表達(dá)水平等計量資料比較采用t檢驗及單因素分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組受試者血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平變化情況比較

與對照組比較，骨肉瘤組患者的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2骨肉瘤組患者的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平與骨肉瘤患者的年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P>0.05）;但TNM分期Ⅱb/Ⅲ者高于Ⅱa分期者，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者高于未轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3術(shù)后隨訪12個月復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平比較

術(shù)后隨訪12個月，復(fù)發(fā)組的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平均高于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3討論

骨肉瘤多起源于長骨干骺端，是一種原發(fā)性間葉組織惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，約占兒童腫瘤的5%[8]。骨肉瘤早期癥狀主要是發(fā)病部位的腫脹和疼痛，特異性不高，易導(dǎo)致臨床上誤診和漏診，研究表明，大部分患者確診時已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[9]。由于骨肉瘤惡性程度高、侵襲性強，臨床治療后緩解期的患者也存在極高的復(fù)發(fā)風(fēng)險，但目前尚缺乏對骨肉瘤早期診斷及預(yù)后評估的腫瘤標(biāo)記物[10]。臨床上尋找特異性強、方便檢測及有效的生物標(biāo)志物在骨肉瘤的早期診斷及預(yù)后評估中具有重要意義。

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其通過各種途徑參與機體的發(fā)育、病毒防御、細(xì)胞增殖和凋亡及腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程的調(diào)控[11]。有研究顯示，miR-19a在多種腫瘤中差異化表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切[12]。研究表明，肝癌組織中miR-19a的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，miR-19a的表達(dá)與組織學(xué)分級、TNM分期和血管侵犯有關(guān)，miR-19a的高表達(dá)與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組的miR-19a水平明顯高于對照組，提示miR-19a可能參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，進(jìn)一步分析miR-19a水平與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，TNM分期Ⅱb/Ⅲ者、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的miR-19a水平高于Ⅱa分期者和未轉(zhuǎn)移者，表明miR-19a的異常表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系密切，與張智勇等[14]研究中miR-19a在胃癌組織中高表達(dá)，miR-19a的高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-19a也是影響胃癌預(yù)后的危險因素。骨肉瘤的特征是侵襲性強和轉(zhuǎn)移率高，患者常伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性病變，使得治療異常困難[15]。MMP-9是MMPs家族的一員，是一種鋅離子依賴性蛋白水解酶，主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，大量研究表明，其與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤內(nèi)血管形成關(guān)系密切[16-17]。體外研究表明，下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)水平可抑制肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[18]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組的MMP-9表達(dá)水平也明顯高于對照組，且TNM分期Ⅱb/Ⅲ者、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者M(jìn)MP-9水平高于Ⅱa分期者和未轉(zhuǎn)移者，表明MMP-9也參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，且與患者病理分期和是否轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。因此，miR-19a與MMP-9具有作為骨肉瘤生物標(biāo)志物的潛力。此外，骨肉瘤具有高致殘率、致死率和復(fù)發(fā)率[19]，本研究隨訪12個月觀察術(shù)后復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組的血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)者的血清miR-19a與MMP-9水平均高于未復(fù)發(fā)者，提示miR-19a與MMP-9高表達(dá)水平與骨肉瘤患者預(yù)后不良有關(guān)，對其檢測在患者預(yù)后評估中具有較高價值，與Gieger TL等[20]研究結(jié)果一致。

綜上所述，骨肉瘤患者血清miR-19a與MMP-9表達(dá)水平明顯升高，其可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，對其檢測在骨肉瘤患者的病情評估及預(yù)后判斷中具有一定價值。

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（收稿日期：2019-01-24）[基金項目] 浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2017KY713）