PHLPP2與Akt表達(dá)對(duì)NSCLC紫杉醇耐藥的臨床意義

林玲 陳美芳 呂冬青 葛宏飛

[摘要] 目的 研究PHLPP2在紫杉醇耐藥非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與Akt表達(dá)的關(guān)系。 方法 采用免疫組化方法分別檢測(cè)160 例非小細(xì)胞肺癌組織中的PHLPP2、Akt表達(dá)，分析PHLPP2在紫杉醇耐藥組和非耐藥組非小細(xì)胞肺癌組織細(xì)胞中的表達(dá)高低及其與Akt表達(dá)的關(guān)系。 結(jié)果 （1）PHLPP2在低中分化肺癌組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)為39.8%，高分化肺癌組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)為70.2%，兩者表達(dá)存在顯著性差異（χ2=13.539，P<0.001）。（2）Akt在Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)為77.0%，在Ⅲb期的陽(yáng)性表達(dá)為56.7%，兩者表達(dá)存在顯著性差異（χ2=7.297，P<0.05）。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性表達(dá)為83.3%，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性表達(dá)為44.8%，兩者表達(dá)存在顯著性差異（χ2=25.804，P<0.001）。在不同的分化程度、性別、年齡、腫瘤最大直徑、組織學(xué)類(lèi)型的表達(dá)差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。（3）PHLPP2表達(dá)在TP方案耐藥組中低表達(dá)率高于非耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043）。（4）Akt表達(dá)在TP方案耐藥組中高表達(dá)率高于非耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）。 結(jié)論 PHLPP2可能通過(guò)調(diào)節(jié)Akt水平減少NSCLC對(duì)紫杉醇治療的耐藥性。

[關(guān)鍵詞] PHLPP2;Akt; 肺癌; 紫杉醇;耐藥

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）17-0028-04

[Abstract] Objective To study the expression of PHLPP2 in paclitaxel-resistant non-small cell lung cancer and its relationship with Akt expression. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of PHLPP2 and Akt in 160 non-small cell lung cancer tissues. The expression of PHLPP2 in paclitaxel-resistant and non-resistant NSCLC tissues， and its relationship with the expression of Akt were analyzed. Results （1）The positive expression of PHLPP2 was 39.8% in poor and middle-differentiated lung cancer tissues， and 70.2% in well-differentiated lung cancer tissues. There was significant difference between the two expressions（χ2=13.539， P<0.001）. （2）The positive expression of Akt in the stage Ⅳ group was 77.0%， and the positive expression in the stage Ⅲb group was 56.7%. There was a significant difference between the two groups（χ2=7.297， P<0.05）. The positive expression of Akt was 83.3% in the lymph node metastasis group and 44.8% in the no lymph node metastasis group. There was a significant difference between the two groups（χ2=25.804， P<0.001）. There were no significant differences in tumor maximum diameter and the expression levels of histological type between different differentiation groups， gender groups， age groups（P>0.05）. （3）The low expression rate of PHLPP2 expression in the TP regimen resistant group was higher than that in the non-resistant group （P=0.043）. （4） The high expression rate of Akt expression in the TP regimen resistant group was higher than that in the non-resistant group， with significant difference（P=0.022）. Conclusion PHLPP2 may reduce the resistance of NSCLC to paclitaxel treatment by regulating Akt levels.

[Key words] PHLPP2; Akt; Lung cancer; Paclitaxel; Drug resistance

肺癌為人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，大多患者在確診時(shí)已經(jīng)是晚期，化療是晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治療手段。紫杉醇為肺癌常用的化療藥物之一，但是化療耐藥一直是導(dǎo)致其治療失敗的主要原因，也是目前治療的難點(diǎn)[1]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，有研究證實(shí)[2]Akt活化與肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥有關(guān)。PHLPP（PH domain leucine-rich repeats protein phosphatase）是一個(gè)新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，其所編碼的PHLPP蛋白可以脫下Akt疏水基團(tuán)的磷酸分子，使Akt失活，成為Akt的負(fù)調(diào)節(jié)物[3]。PHLPP2為PHLPP家族的同工酶之一。為探索PHLPP是否可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt水平以減少NSCLC對(duì)紫杉醇治療的耐藥性，本實(shí)驗(yàn)以 PHLPP2和Akt為觀察指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)紫杉醇耐藥組和非耐藥組NSCLC組織中免疫組化表達(dá)變化，觀察PHLPP2和Akt兩者的關(guān)系及與紫杉醇耐藥發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源

2015年1月～2017年12月本院病理組織庫(kù)采集的160例非小細(xì)胞肺癌均經(jīng)病理診斷明確。其中男100例，女60例，年齡43～72歲，平均55.3歲，鱗癌80例，腺癌80例。依據(jù) 2009 年國(guó)際肺癌研究會(huì)（IASLC）第7版肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，其中Ⅲb期60例，Ⅳ期100例。高分化57例，中低分化103例。標(biāo)本為肺癌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。所有病例均有可評(píng)價(jià)病灶，全身功能狀態(tài)（ECOG）評(píng)分≤2分。

1.2 方法

隨機(jī)分為兩組，每組各80例。試驗(yàn)組給予紫杉醇/順鉑（TP）方案：順鉑25 mg/（m2·d），靜滴，第1～3天，21 d為一個(gè)周期;紫杉醇175 mg/m2，靜滴，第1天。2個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效。對(duì)照組給予吉西他濱/順鉑（GP）方案：吉西他濱1 g/m2，靜滴，第1天、第8天;順鉑25 mg/（m2·d），靜滴，第1～3天，每3周1次。2個(gè)周期后評(píng)價(jià)療效。PHLPP2與Akt免疫組化測(cè)定采用PowerVision二步法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。已知PHLPP2與Akt陽(yáng)性的癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，PHLPP2與Akt蛋白免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)，參照文獻(xiàn)[6]由一名高年資病理科主任醫(yī)師與一名高年資病理科主治醫(yī)師雙盲法統(tǒng)計(jì)結(jié)果。陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒染色，主要定位于胞漿內(nèi)。在癌巢組織中，計(jì)算陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)占總癌細(xì)胞數(shù)的百分比，陽(yáng)細(xì)胞≥25%為陽(yáng)性，<25%為陰性。染色結(jié)果根據(jù)著色強(qiáng)度用四分層進(jìn)行計(jì)數(shù)（陰性=0，最弱=1，中度=2，強(qiáng)=3）。0～1分為低表達(dá)，2～3分為高表達(dá)。

1.3 主要試劑

抗PHLPP2兔單克隆抗體（貨號(hào)：ARG53458）規(guī)格：100 μL、抗Akt兔多克隆抗體（貨號(hào)：ARG56418）規(guī)格：50 μL，均由臺(tái)灣arigo公司提供，2℃～8℃ 儲(chǔ)存。

1.4 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

化療2個(gè)療程結(jié)束后按照RECIST1.1評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定[5]。淋巴結(jié)短軸值> 15 mm是可測(cè)量病灶。CR：所有靶病灶完全消失，病理性淋巴結(jié)短軸值<1.0 cm;PR：靶病灶最大長(zhǎng)徑之和在4周內(nèi)持續(xù)減少 30.0%以上;PD：最大長(zhǎng)徑之和增加20.0%以上或有新病灶出現(xiàn);SD：目標(biāo)病灶最大長(zhǎng)徑之和減少低于30.0%或增加不足20.0%。以取得CR或PR為化療敏感，否則為耐藥。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，兩蛋白表達(dá)之間的比較采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PHLPP2與Akt的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

PHLPP2陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒染色，主要定位于胞漿內(nèi)，細(xì)胞間隙也可見(jiàn)其陽(yáng)性染色，見(jiàn)封三圖1。Akt陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒染色，主要定位于胞漿內(nèi)，細(xì)胞間隙也可見(jiàn)其陽(yáng)性染色，見(jiàn)封三圖2。根據(jù)免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)，160例肺癌組織內(nèi)PHLPP2陽(yáng)性表達(dá)81例，陽(yáng)性率為50.6%，肺癌組織內(nèi)Akt陽(yáng)性表達(dá)111例，陽(yáng)性率為69.4%，見(jiàn)表1。PHLPP2在低中分化肺癌組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)為39.8%，高分化肺癌組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)為70.2%，兩者表達(dá)存在顯著性差異（χ2=13.539，P<0.001）;在不同的性別、年齡、腫瘤最大直徑、TNM分期、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移的表達(dá)差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。Akt在Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)為77.0%，在Ⅲb期的陽(yáng)性表達(dá)為56.7%，兩者表達(dá)存在顯著性差異（χ2=7.297，P<0.05）;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性表達(dá)為83.3%，在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性表達(dá)為44.8%，兩者表達(dá)存在顯著性差異（χ2=25.804，P<0.001）;在不同的分化程度、性別、年齡、腫瘤最大直徑、組織學(xué)類(lèi)型的表達(dá)差異均無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.2 PHLPP2與Akt在TP與GP化療方案耐藥及非耐藥組中表達(dá)程度及相關(guān)性

PHLPP2表達(dá)在TP方案耐藥組中低表達(dá)率高于非耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.043<0.05）;Akt表達(dá)在TP方案耐藥組中高表達(dá)率高于非耐藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022<0.01）。見(jiàn)表2。PHLPP2與Akt表達(dá)在GP方案耐藥組與非耐藥組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

紫杉醇作為一種微管靶向抗腫瘤藥物，為肺癌常用的化療藥物之一，在肺癌治療上具有良好的療效而廣泛使用，但是腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐藥是治療失敗的重要原因[7]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)Akt信號(hào)通路與多種腫瘤的化療耐藥和預(yù)后有關(guān)[8，9]，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在惡性腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥中具有重要的影響，其作用主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成[10-12]。在肺癌組織中，Akt信號(hào)通路被明顯活化，并且P-Akt呈現(xiàn)高表達(dá)[13]。國(guó)內(nèi)研究[14]顯示紫杉醇耐藥肺癌A549細(xì)胞（A549/T細(xì)胞）在用 AS1411處理后Akt的蛋白水平均有下調(diào)，細(xì)胞的活性與克隆形成能力都受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，該研究提示Akt的活化與肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥有關(guān)。體外試驗(yàn)研究[15]證明了紫杉醇能激活ERK1/2通路誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡。PHLPP 是一個(gè)新的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，PHLPP2基因定位于16號(hào)染色體，是PHLPP家族中三個(gè)同工酶中的其中一個(gè)。Gao等[3]2005年發(fā)現(xiàn)其所編碼的PHLPP蛋白可以脫下Akt的疏水基團(tuán)Ser473位點(diǎn)一個(gè)磷酸分子，PHLPP蛋白可以脫下Akt的疏水基團(tuán)Ser473位點(diǎn)一個(gè)磷酸分子，使Akt失活，拮抗細(xì)胞內(nèi)P13K/Akt信號(hào)通路，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，證實(shí)其為腫瘤抑制基因的角色。

PHLPP已經(jīng)被證明能使Akt脫去磷酸后失去活性，從而成為Akt的負(fù)調(diào)節(jié)物[16]。有研究在H157細(xì)胞（NSCLC細(xì)胞）和乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)PHLPP的超表達(dá)導(dǎo)致Akt活性降低，使得細(xì)胞凋亡增加，然而PHLPP的敲除使得Akt活性增加，使得細(xì)胞凋亡減少[17]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PHLPP在慢性淋巴細(xì)胞白血病、乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、黑色素瘤呈現(xiàn)低表達(dá)，并且惡性膠質(zhì)瘤患者的PHLLP表達(dá)越高，其存活率也越高[18]。在結(jié)腸癌的研究中也證實(shí)了PHLPP是一種腫瘤抑制因子，J Liu等報(bào)道了PHLPP二個(gè)同工酶在結(jié)腸癌標(biāo)本和臨近正常組織中免疫組化的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PHLPP1和PHLPP2在腫瘤組織中丟失或者減少分別是78%和86%，同時(shí)PHLPP在結(jié)腸癌細(xì)胞的超表達(dá)能減少細(xì)胞增殖，并且通過(guò)抑制Akt信號(hào)通道能很大程度地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[19]，從而表明PHLPP參與腫瘤生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，提示PHLPP作為腫瘤抑制因子將有可能用于Akt水平升高的癌癥治療。PHLPP2通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制細(xì)胞周期進(jìn)展并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡[20]，但PHLPP2在肺癌組織中的表達(dá)譜尚不清楚。研究已確定 PHLPP2基因是終止致癌Akt信號(hào)傳導(dǎo)特異性和有效的必需磷酸酶[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)PHLPP2在低中分化肺癌組織內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)率較高分化的表達(dá)低，提示PHLPP2的低表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的惡性分化程度。Akt在Ⅳ期的陽(yáng)性表達(dá)較Ⅲb期高，和肺癌晚期腫瘤分期相關(guān)。Akt陽(yáng)性表達(dá)和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦存在相關(guān)性，與研究一致[22-24]，考慮Akt的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。PHLPP2表達(dá)在TP方案耐藥組中低表達(dá)率明顯高于非耐藥組，Akt表達(dá)在TP方案耐藥組中高表達(dá)率明顯高于非耐藥組，而PHLPP2與Akt表達(dá)在GP方案耐藥組與非耐藥組中表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，我們認(rèn)為Akt的活化與肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥可能有關(guān)，PHLPP2可能通過(guò)調(diào)節(jié)Akt水平減少NSCLC對(duì)紫杉醇治療的耐藥性。該研究局限于病理組織，本團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步探索在細(xì)胞學(xué)方面的耐藥機(jī)制試驗(yàn)。

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（收稿日期：2019-03-18）