柑 橘 渣 中 柚 皮 苷 的 提 取 純 化 工 藝

王 敬 齊仁立 邱曉宇 孫 倩 黃金秀 王 琪

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460）

柚皮苷（Naringin，也稱為柚苷、柑橘苷、異橙皮苷）是一種二氫黃酮類化合物，含有多個(gè)芳香族羥基，主要存在于柚、橘、橙等柑橘類水果的外層果皮中[1]。試驗(yàn)證明它具有抗氧化[2]、降血脂[3]、抗炎[4]和抗癌[5]等多種生物學(xué)功效，已有研究表明，柚皮苷添加到畜禽飼料中具有調(diào)控脂肪代謝，改善肉品質(zhì)和減少熱應(yīng)激等作用[6-7]，因此柚皮苷是一種新型綠色的飼料添加劑資源。重慶、四川等西南地區(qū)是我國柑橘主產(chǎn)區(qū)，每年柑橘加工會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物——柑橘渣，柑橘渣中含有較多柚皮苷，為柚皮苷的廣泛應(yīng)用奠定了原料基礎(chǔ)。人們目前主要通過填埋和倒入江河等方式處理柑橘渣，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，從柑橘渣中提取柚皮苷具有一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值，但目前還未有相關(guān)試驗(yàn)報(bào)道。柚皮苷的提取方法主要有溶劑提取、回流提取、超聲波輔助提取和微波輔助提取等[8-10]。其中，溶劑提取是應(yīng)用甲醇、乙醇和氯仿等溶劑在一定溫度下將柑橘渣浸泡一定時(shí)間，使柚皮苷溶解于溶劑之中，從而達(dá)到提取目的。此法操作簡單，成本低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。超聲波輔助提取則是在溶劑提取的基礎(chǔ)上，利用超聲所產(chǎn)生的空化、攪拌和震動(dòng)等效應(yīng)，使柚皮苷的提取更為快速和高效。此法具有提取時(shí)間短，產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，但要求較高的設(shè)備配置，但隨著相應(yīng)設(shè)備的普及，超聲波輔助提取將會(huì)有較大的前景。柚皮苷提取后，還需進(jìn)行分離純化，分離純化方法主要有柱層析[11]、超濾技術(shù)[12]和大孔樹脂吸附法[13]等。其中大孔樹脂吸附法穩(wěn)定性好，耐化學(xué)腐蝕，可重復(fù)使用，適用于工業(yè)生產(chǎn)[14]。因此，本試驗(yàn)采用溶劑（乙醇）提取法和超聲波輔助提取法從柑橘渣中提取柚皮苷，并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定兩者的最優(yōu)工藝參數(shù)。然后通過吸附解吸試驗(yàn)，篩選出最適宜分離純化柚皮苷的大孔樹脂及工藝條件。為高效提取純化柚皮苷提供參考工藝，增加柚皮苷產(chǎn)量，使得柚皮苷作為一種新型綠色添加劑在飼料生產(chǎn)中發(fā)揮重要價(jià)值。

1 材料與設(shè)備

柑橘渣（選取新鮮柑橘渣于50 ℃烘箱中烘至48 h，粉碎后過40 目篩，用自封袋收集并密封保存于-20 ℃冰箱備用）；無水乙醇、氫氧化鈉均為分析純，重慶川東化工有限公司；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，Solarbio公司；大孔樹脂(HPD600、AB8、HPD100、HP20、D101)，河北翔藍(lán)化工有限公司。

101 型電熱鼓風(fēng)烘箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FW80高速萬能研碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩，浙江上虞市肖金篩具廠；DK-8D三溫三控恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗儀，江蘇省昆侖山市超聲儀器有限公司；BIOTEK-H1 紫外分光光度計(jì)，中國香港基因有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 柚皮苷的含量測(cè)定

2.1.1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

參考許鷺[15]的方法，準(zhǔn)確稱取80 mg 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，無水乙醇定容至50 ml 容量瓶中，得0.16 g/l 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 ml上述溶液于10 ml 比色管中，依次加入無水乙醇5 ml和4 mol/l NaOH 溶液0.1 ml，然后加蒸餾水補(bǔ)充至刻度線，充分搖勻后于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，迅速冷卻后于420 nm 處測(cè)定吸光度，設(shè)定3 個(gè)平行，取平均值。以柚皮苷濃度X為橫坐標(biāo)，吸光度Y為縱坐標(biāo)作圖，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為：Y=33.348X-0.001 2，R2=0.999 9。

2.1.2 柚皮苷提取率的計(jì)算

準(zhǔn)確稱取柑橘渣粉末（w）進(jìn)行提取，過濾后定容至50 ml 容量瓶中，準(zhǔn)確吸取一定體積（v）濾液至10 ml 比色皿中，依次加入無水乙醇5 ml 和4 mol/l NaOH溶液0.1 ml，然后加蒸餾水補(bǔ)充至刻度線，充分搖勻后于40 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，迅速冷卻后于420 nm處測(cè)定吸光度，對(duì)應(yīng)柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到稀釋液的濃度（C），按公式（1）計(jì)算提取率。設(shè)定3個(gè)平行，取平均值。

式中：C——稀釋液中柚皮苷濃度（mg/ml）；

V——提取液用量（ml）；

W——柚皮粉末質(zhì)量（g）。

2.2 乙醇提取

2.2.1 乙醇提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取柑橘渣粉末0.500 g，在一定的試驗(yàn)條件下分別考察不同水平乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)柚皮苷提取率的影響，確定各因素正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的考察范圍。

用乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25 g/ml，提取時(shí)間1 h，提取溫度60 ℃作為進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)研究某一單因素時(shí)，其他條件保持不變。

2.2.2 乙醇提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素考察試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度這4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平值，依照L9（34）正交表安排試驗(yàn)。

2.3 超聲波輔助提取

2.3.1 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取柑橘渣粉末0.500 g，在一定的試驗(yàn)條件下分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度和超聲波頻率對(duì)柚皮苷提取率的影響，確定各因素正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的考察范圍。

用乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶40 g/ml，提取時(shí)間30 min，提取溫度60 ℃，提取功率400 W作為進(jìn)行單因素篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件。當(dāng)研究某一單因素時(shí)，其他條件保持不變。

2.3.2 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比，提取時(shí)間，提取溫度和超聲波功率這5個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素選擇4個(gè)水平值，依照L16(45)正交表安排試驗(yàn)。

2.4 柚皮苷的純化工藝

2.4.1 大孔樹脂的篩選

本試驗(yàn)選擇了HPD600、AB8、HPD100、HP20 和D101 共5 種大孔樹脂，通過吸附和解吸試驗(yàn)，篩選出最適合純化柚皮苷的大孔樹脂。

2.4.1.1 大孔樹脂預(yù)處理

用95%乙醇浸泡樹脂24 h，使樹脂充分溶脹。采用濕法裝柱，用乙醇洗至流出液不呈白色渾濁現(xiàn)象，用蒸餾水洗去乙醇。用2%的NaOH溶液以2 BV/h的流速通過樹脂柱，蒸餾水洗至中性。再用5% HCl 溶液以2 BV/h 的流速通過樹脂柱，最后用蒸餾水以2 BV/h的流速洗至中性。

2.4.1.2 大孔樹脂試驗(yàn)

參照許鷺[15]的方法，準(zhǔn)確稱取5種樹脂各3.0 g于50 ml 錐形瓶中，加入已知濃度（C1）的柚皮苷提取液20 ml（V1），將錐形瓶封口后置于恒溫振蕩器上振蕩吸附12 h，振蕩溫度為40 ℃，振蕩頻率為100 r/min。充分吸附后過濾，測(cè)定濾液中柚皮苷濃度（C2）。按公式（2）計(jì)算吸附率E。

再將吸附飽和的樹脂置于50 ml 錐形瓶中，加入0.05 mol/l Na0H 溶液30 ml，置于振蕩器上振蕩解吸12 h，然后測(cè)定溶液（V3）中柚皮苷的濃度（C3）。按公式（3）計(jì)算解吸率D。

式中：E——吸附率（%）；

C1——提取液初始濃度（mg/ml）；

C2——吸附后提取液濃度（mg/ml）；

D——解吸率（%）；

C3——解吸后提取液濃度（mg/ml）；

V3——解吸液體積（ml）；

V1——提取液體積（ml）。

2.4.2 大孔樹脂純化工藝參數(shù)

篩選出最適合純化柚皮苷的大孔樹脂后，將此種樹脂按2.4.1.1 的方法預(yù)處理后濕法裝柱。選用5 個(gè)相同型號(hào)的柱子，分別裝入3.0 g 大孔樹脂。將柚皮苷提取液上柱，考察吸附時(shí)間、樣品液pH 值、上樣流速對(duì)柚皮苷吸附率的影響；對(duì)已吸附飽和的大孔樹脂進(jìn)行解吸試驗(yàn)，考察洗脫液濃度、洗脫流速對(duì)柚皮苷解吸率的影響。通過上述吸附和解吸試驗(yàn)，篩選出大孔樹脂的最優(yōu)工藝條件。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 乙醇提取法

3.1.1 乙醇提取單因素試驗(yàn)

（1）提取時(shí)間（見圖1）：隨著提取時(shí)間增加，柚皮苷提取率逐漸升高。但與2.5 h 的柚皮苷提取率相比，3.5 h和5.0 h的柚皮苷提取率并未增加多少，由此確定2.5 h為最佳提取時(shí)間。

圖1 提取時(shí)間對(duì)柚皮苷提取率的影響

（2）料液比（見圖2）：料液比達(dá)到1∶40 g/ml 以后，柚皮苷提取率基本不再上升。從成本的角度考慮，選擇1∶40 g/ml為最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)柚皮苷提取率的影響

（3）乙醇體積分?jǐn)?shù)(見圖3)：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，柚皮苷提取率達(dá)到最大值，繼續(xù)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，柚皮苷提取率開始下降，由此確定70%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

（4）提取溫度（見圖4）：隨著提取溫度的升高，柚皮苷提取率逐漸上升，80 ℃時(shí)柚皮苷提取率達(dá)到最大值。由此確定最適提取溫度為80 ℃。

3.1.2 乙醇提取正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)柚皮苷提取率的影響

表1 乙醇提取因素水平

表2 乙醇提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 乙醇提取方差分析

通過極差分析（表2）可知，在正交試驗(yàn)條件下，4個(gè)因素對(duì)柚皮苷提取率的影響從大到小依次是：提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。根據(jù)方差分析（表3）結(jié)果，提取時(shí)間、料液比和提取溫度對(duì)柚皮苷提取率的影響差異顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷提取率的影響差異不顯著。綜上，乙醇提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為A3B3C1D3，即提取時(shí)間3.5 h，料液比1∶45 g/ml，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取溫度80 ℃。在此工藝參數(shù)下，柚皮苷提取率為15.09 mg/g。

3.2 超聲波輔助提取

3.2.1 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

（1）乙醇體積分?jǐn)?shù)（見圖5）：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，柚皮苷提取率逐漸升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，柚皮苷提取率處于最高水平。由此確定最適乙醇提取分?jǐn)?shù)為70%。

（2）料液比（見圖6）：隨著料液比逐漸增加，柚皮苷提取率也逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶60 g/ml 時(shí)，柚皮苷提取率基本不再升高。由此確定最適料液比為1∶60 g/ml。

（3）提取時(shí)間（見圖7）：提取時(shí)間增加，柚皮苷提取率也在逐漸上升，但在70 min 以后，提取率并未增加太多，考慮到工作效率的問題，確定70 min 為最佳提取時(shí)間。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)柚皮苷提取率的影響

圖6 料液比對(duì)柚皮苷提取率的影響

圖7 提取時(shí)間對(duì)柚皮苷提取率的影響

（4）提取溫度（見圖8）：提取溫度升高，柚皮苷提取率逐漸上升，80 ℃時(shí)柚皮苷提取率達(dá)到最大值。由此確定最適提取溫度為80 ℃。

圖8 提取溫度對(duì)柚皮苷提取率的影響

（5）超聲波頻率（見圖9）：隨著超聲波頻率增加，柚皮苷提取率也在上升，當(dāng)超聲波頻率達(dá)到450 W時(shí)，柚皮苷提取率基本不再升高。由此確定最適超聲波頻率為450 W。

圖9 超聲波頻率對(duì)柚皮苷提取率的影響

3.2.2 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、超聲波頻率5個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 超聲波輔助提取因素水平

通過極差分析（表5）可知，在正交試驗(yàn)條件下，5 個(gè)因素對(duì)柚皮苷提取率的影響從大到小依次是：超聲波頻率＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞料液比＞提取時(shí)間。根據(jù)方差分析（表6）結(jié)果，超聲波頻率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和料液比對(duì)柚皮苷提取率的影響差異顯著，提取時(shí)間對(duì)柚皮苷提取率的影響差異不顯著。綜上得到超聲波輔助提取法的最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B4C4D4E4，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶60 g/ml，提取時(shí)間90 min，提取溫度80 ℃，超聲波頻率500 W。在此工藝參數(shù)下，柚皮苷提取率為24.15 mg/g。

3.3 柚皮苷的純化工藝

3.3.1 大孔樹脂的篩選

表5 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 超聲波輔助提取方差分析

表7 大孔樹脂的吸附率和解吸率比較

如表7所示，大孔樹脂HPD600的吸附率最高，解吸率僅低于HPD100；HPD100 的解吸率最高，但其吸附率很低。綜合吸附率和解吸率，大孔樹脂HPD600的效果最佳，是最適合純化柚皮苷的大孔樹脂。

3.3.2 大孔樹脂純化工藝參數(shù)

圖10 吸附時(shí)間對(duì)柚皮苷吸附率的影響

3.3.2.1 吸附時(shí)間對(duì)柚皮苷吸附率的影響(見圖10)由圖10 可知，在0.5～4.0 h 范圍內(nèi)，大孔樹脂HPD600對(duì)柚皮苷的吸附率隨著吸附時(shí)間增加有較為顯著的提高，在4.0 h 時(shí)達(dá)到最大值。隨著吸附時(shí)間的繼續(xù)增加，柚皮苷的吸附率基本保持不變，吸附時(shí)間為4.0 h是比較理想的選擇。

3.3.2.2 樣品pH值對(duì)柚皮苷吸附率的影響(見圖11)

圖11 樣品pH值對(duì)柚皮苷吸附率的影響

由圖11可知，當(dāng)樣品pH值為4時(shí)，大孔樹脂對(duì)柚皮苷的吸附率達(dá)到最大值。隨著樣品pH 值的增加，吸附率逐漸降低。因此，樣品pH 值為4 最適合大孔樹脂純化。

3.3.2.3 上樣流速對(duì)柚皮苷吸附率的影響(見圖12)

圖12 上樣流速對(duì)柚皮苷吸附率的影響

由圖12可知，隨著上樣流速的增加，柚皮苷吸附率逐漸降低，當(dāng)上樣流速為1 BV/h 時(shí)，柚皮苷吸附率最大。但在實(shí)際生產(chǎn)中還應(yīng)考慮到時(shí)間成本，因此本試驗(yàn)選擇2 BV/h為最佳上樣流速，這樣既能保證較高的吸附率，又能減少整體時(shí)間消耗。

3.3.2.4 洗脫液濃度對(duì)柚皮苷解吸率的影響(見圖13)

圖13 NaOH濃度對(duì)柚皮苷解吸率的影響

由圖13可知，當(dāng)洗脫液NaOH的濃度為0.05 mol/l時(shí)，柚皮苷解吸率達(dá)到最大值。隨著洗脫液濃度增加，柚皮苷解吸率逐漸降低。NaOH濃度為0.05 mol/l是適合大孔樹脂純化的參數(shù)。

3.3.2.5 洗脫流速對(duì)柚皮苷解吸率的影響(見圖14)

由圖14可知，隨著解吸流速的增加，柚皮苷解吸率逐漸減低，當(dāng)解吸流速為1 BV/h 時(shí)，柚皮苷解吸率最大。但在實(shí)際生產(chǎn)中還應(yīng)考慮到時(shí)間成本，因此本試驗(yàn)選擇2 BV/h為最佳解吸流速。

4 結(jié)論

采用乙醇提取法提取柑橘渣中柚皮苷的最優(yōu)工藝參數(shù)為：提取時(shí)間3.5 h，料液比1∶45 g/ml，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，提取溫度80 ℃。在此條件下，柚皮苷提取率為15.09 mg/g。采用超聲波輔助提取法提取柑橘渣中柚皮苷的最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶60 g/ml，提取時(shí)間90 min，提取溫度80 ℃，超聲波頻率500 W。在此條件下，柚皮苷提取率為24.15 mg/g。通過比較5 種大孔樹脂對(duì)柚皮苷的吸附和解吸率，HPD600具有良好的吸附和解吸效果，是最適合純化柚皮苷的大孔樹脂。HPD600的最優(yōu)工藝條件為：吸附時(shí)間4.0 h，樣品pH值4，上樣流速2 BV/h，洗脫液濃度0.05 mol/l，解吸流速2 BV/h。

圖14 洗脫流速對(duì)柚皮苷解吸率的影響

乙醇提取和超聲波輔助提取均能獲得較高濃度的柚皮苷，以乙醇替代酸堿[16]和有毒有害有機(jī)溶劑[17]的使用，毒害作用小，方法簡便，成本低廉，適用于工業(yè)生產(chǎn)。HPD600 具有良好的吸附和解吸效果，適用于柚皮苷的分離純化。有研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞的飼料中添加0.15%柚皮苷能降低雞肉中氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，增加雞肉抗氧化力，此外，柚皮苷減少了胸肌中棕櫚酸的含量，增加了多不飽和脂肪酸的含量[18]。也有試驗(yàn)表明，0.5%柚皮苷能提升豬肉肉色紅度，使得豬肉品質(zhì)有所提升[19]。上述研究提示，柚皮苷具有提高肌肉抗氧化性能、調(diào)控脂肪代謝和改善肉品質(zhì)等生物學(xué)功能，適合作為飼料添加劑或者動(dòng)物保健藥品在飼料工業(yè)中應(yīng)用。綜上，柑橘渣中柚皮苷的提取純化工藝，為飼料工業(yè)中柚皮苷的高效獲取提供了參考方法，這為柚皮苷在飼料中的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。