大麻素2型受體激動(dòng)劑JWH133對人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞體外增殖以及細(xì)胞因子表達(dá)影響的研究

胡 浩，魏志平，劉彥群

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（endocannabinoid system，ECS）是由內(nèi)源性大麻素、大麻素受體——G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）以及相關(guān)的酶所組成的一種具有調(diào)節(jié)多種生理病理過程的信號(hào)系統(tǒng)，ECS在皮膚以及附屬器的各種細(xì)胞類型中對細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞因子等產(chǎn)生發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[1]。研究發(fā)現(xiàn)，大麻素2型受體（cannabinoid type 2 receptor，CB2R）在銀屑病皮損的角質(zhì)形成細(xì)胞中大量表達(dá)，且主要分布于棘細(xì)胞層[2]。大麻素2型受體激動(dòng)劑JWH133具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及免疫反應(yīng)的作用[1]。本研究初步揭示了JWH133對HaCaT細(xì)胞體外增殖、凋亡以及在腫瘤壞死因子（TNF）-α誘導(dǎo)下細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的影響，旨在探索JWH133對角質(zhì)形成細(xì)胞的生物學(xué)作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要設(shè)備

人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）株（上海復(fù)祥生物科技有限公司），大麻素2型受體激動(dòng)劑JWH133（美國Tocris公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司），TNF-α（美國PeproTech公司），人細(xì)胞因子檢測試劑盒（美國R&D公司），人白細(xì)胞介素（IL）-19、IL-22、IL-23酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），多功能熒光化學(xué)發(fā)光成像儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。JWH133以二甲基亞砜（DMSO）配制成濃度為50 mmol/L 儲(chǔ)存液（DMSO 濃度 ≤ 2‰），-20℃避光保存，使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿瓶底后，以含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h貼壁后，更換無血清、無雙抗DMEM培養(yǎng)基，并加入不同濃度JWH133。檢測JWH133對HaCaT細(xì)胞抑制率以及凋亡率實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)分5組，分別為15、30、60 μmol/L JWH133組、溶媒組（含與60 μmol/L JWH133等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基）、陰性組（只含DMEM培養(yǎng)基）。檢測JWH133對TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中有關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)中，實(shí)驗(yàn)分3組，分別為陰性組（只含DMEM 培 養(yǎng) 基）、 TNF-α 組（含有 20 ng/ml TNF-α DMEM 培養(yǎng)基）、TNF-α+30 μmol/L JWH133 組（先將含有20 ng/ml TNF-α DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理2 h，再加30 μmol/L JWH133），3組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)24 h，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1.2.2 CCK8法檢測JWH133對HaCaT細(xì)胞體外增殖的抑制作用 取HaCaT細(xì)胞5×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔為 100 μl，置于 37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，實(shí)驗(yàn)分組如上所述，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12、24、36 h后終止培養(yǎng)，棄去原培養(yǎng)基，將無血清、無雙抗DMEM培養(yǎng)基與CCK-8試劑按10:1比例混勻，每孔加入100 μl混勻液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處每孔的吸光度（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=（1-給藥組A值/陰性對照組A值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測JWH133對HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長至70%～80%融合時(shí)，按上述實(shí)驗(yàn)分組用不同濃度JWH133處理細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后以胰蛋白酶處理細(xì)胞，約3～5 min后用含血清的培養(yǎng)基終止消化，用預(yù)冷的PBS輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，4℃1 000 r/min離心×5 min后棄上清，重復(fù)3次，將各組分別加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，并分別加入5 μl Annexin V-FITC混勻后加入5 μl碘化丙啶（PI），混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.2.4 抗體蛋白芯片檢測JWH133對HaCaT細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，按上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，并檢測蛋白濃度。每個(gè)樣本實(shí)驗(yàn)區(qū)的微陣列中固定了105種細(xì)胞因子的抗體及陽性和陰性對照，每個(gè)細(xì)胞因子位點(diǎn)重復(fù)測定2次。具體操作按照試劑盒的說明書進(jìn)行，其主要步驟如下：①每張膜加入2 ml Array Buffer孵育1 h做封閉處理。②每個(gè)Array單元分別加入200 μg樣本稀釋液4℃孵育過夜。③洗膜后分別加入稀釋過的檢測抗體，室溫孵育1 h。④洗膜后分別加入鏈霉親和素-HRP，室溫孵育30 min。⑤洗膜后分別加入1 ml化學(xué)顯色試劑。⑥化學(xué)發(fā)光成像儀上顯色及數(shù)據(jù)處理與分析。

表1 不同濃度JWH133作用HaCaT細(xì)胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用 （±s，n=3）

表1 不同濃度JWH133作用HaCaT細(xì)胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用 （±s，n=3）

注：A值：吸光度值；與陰性組相比，aP＞0.05；與溶媒組相比，bP＜0.05

組 別 12 h 24 h 36 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）陰性組 0.934±0.041 0 1.389±0.026 0 1.677±0.026 0溶媒組 0.920±0.022 a 1.47±2.31 a 1.372±0.031 a 1.24±0.59 a 1.646±0.024 a 1.84±1.45 a 15 μmol/L 0.736±0.021 b 21.02±4.29 b 0.646±0.021 b 53.52±1.47 b 0.429±0.028 b 74.42±1.38 b 30 μmol/L 0.630±0.021 b 32.41±4.26 b 0.396±0.012 b 71.46±0.97 b 0.254±0.018 b 84.85±0.88 b 60 μmol/L 0.486±0.010 b 47.90±3.30 b 0.265±0.018 b 80.92±1.07 b 0.207±0.014 b 87.68±0.76 bimages/BZ_8_1059_407_1106_449.pngimages/BZ_8_1640_406_1687_447.png

1.2.5 雙抗體夾心ELISA法檢測IL-19、IL-22、IL-23水平 取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，按上述實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞上清，離心后采用ELISA法檢測IL-19、IL-22、IL-23水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，每個(gè)樣本設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀讀取450 nm處A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組IL-19、IL-22、IL-23的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各組HaCaT細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間的變化采用重復(fù)測量的方差分析。多個(gè)均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）?？贵w芯片結(jié)果采用HLIMAGE數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，取經(jīng)過軟件系統(tǒng)自動(dòng)排除背景后每個(gè)細(xì)胞因子重復(fù)點(diǎn)灰度值的平均值（PAIRS）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 JWH133對HaCaT細(xì)胞體外增殖的影響

重復(fù)測量的方差分析顯示JWH133對HaCaT細(xì)胞體外抑制的抑制率有時(shí)間依賴性（F= 187.1，P＜0.05）；JWH133對HaCaT細(xì)胞體外抑制也有濃度依賴性（F= 2678.9，P＜0.05）；藥物濃度和時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（F= 1177.4，P＜0.05），說明時(shí)間因素的變化趨勢隨藥物濃度不同而不同。15 μmol/L JWH133作用12 h即開始表現(xiàn)出對HaCaT細(xì)胞體外抑制作用（圖1）。與陰性組相比，各濃度JWH133對HaCaT細(xì)胞體外增殖具有抑制作用（P均＜ 0.05，表1），且各濃度JWH133組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.05），JWH133濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。隨著時(shí)間延長，各濃度JWH133對HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用亦逐漸增強(qiáng)，12～24 h的抑制率較24～36 h上升更快，故選擇24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)。各時(shí)間點(diǎn)溶媒組HaCaT細(xì)胞體外抑制率與陰性組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞ 0.05）。

2.2 JWH133對HaCaT細(xì)胞體外凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示（表2），15、30、60 μmol/L JWH133作用HaCaT細(xì)胞24 h后，早期及中晚期細(xì)胞總凋亡率分別為（12.07±0.21）%、（18.13±0.21）%、（21.77±0.40）%，與陰性組（4.34±0.07）%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。溶媒組（4.79±0.06）%與陰性組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中60 μmol/L JWH133組作用最強(qiáng)。

2.3 JWH133對HaCaT細(xì)胞有關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

圖1 不同濃度JWH133作用HaCaT細(xì)胞12、24、36 h后對其體外增殖的抑制作用

表2 不同濃度JWH133作用HaCaT細(xì)胞24 h后對細(xì)胞凋亡的影響 （±s，n=3）

表2 不同濃度JWH133作用HaCaT細(xì)胞24 h后對細(xì)胞凋亡的影響 （±s，n=3）

注：與陰性組相比，aP＞0.05；與溶媒組相比，bP＜0.05

組 別 凋亡率（%）陰性組 4.34±0.07溶媒組 4.79±0.06 a 15 μmol/L 12.07±0.21 b 30 μmol/L 18.13±0.21 b 60 μmol/L 21.77±0.40 b

通過抗體芯片檢測技術(shù)篩查與銀屑病相關(guān)的細(xì)胞因子后發(fā)現(xiàn)（圖2、3），HaCaT細(xì)胞經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后 IL-19、IL-22、IL-23、瘦素（leptin）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、單核細(xì)胞趨化因子（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN或 CD147）表達(dá)均有不同程度增加，其中IL-19表達(dá)明顯增加，JWH133處理TNF-α誘導(dǎo)后的各細(xì)胞因子總體表達(dá)量下降，其中IL-19、IL-22、IL-23、leptin、LIF、MCP-1、MIF表達(dá)均低于陰性組中相對應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)量。通過雙抗體夾心ELISA法進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果的可靠性，結(jié)果見表3。陰性組中IL-19、IL-22、IL-23均有微量的分泌，分別為（53.269±9.439）pg/ml、（28.676±2.667）pg/ml、（19.695±3.668）pg/ml，經(jīng) TNF-α 誘 導(dǎo) 后 3種因子分泌不同程度的增加，分別為增加至（88.800±16.064）pg/ml、（49.994±5.214）pg/ml、（25.584±1.987）pg/ml，加入 30 μmol/L JWH133作用后均抑制了這3種因子的分泌，分別為（52.692±11.368）pg/ml、（32.147±3.452）pg/ml、（20.123±2.173）pg/ml（P均＜ 0.05），與抗體芯片檢測結(jié)果基本一致。

圖2 抗體芯片檢測有關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

圖3 各實(shí)驗(yàn)組有關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)變化關(guān)系

表3 各實(shí)驗(yàn)組IL-19、IL-22、IL-23水平比較 （±s，n=3，pg/ml）

表3 各實(shí)驗(yàn)組IL-19、IL-22、IL-23水平比較 （±s，n=3，pg/ml）

注: a：與陰性組相比，P＞0.05；b：與TNF-α組相比，P＜0.05

組 別 IL-19 IL-22 IL-23陰性組 53.269±9.439 28.676±2.667 19.695±3.668 TNF-α組 88.800±16.064 a 49.994±5.214 a 25.584±1.987 a TNF-α+JWH133組 52.692±11.368 b 32.147±3.452 b 20.123±2.173 b F值 10.775 33.976 5.848 P值 ＜ 0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

3 討論

大麻素是一類具有多種藥理活性的化合物，從結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上類似于植物大麻中提取出來的天然大麻素——四氫大麻醇（THC），這些化合物能夠在各種類型的皮膚疾病中得到應(yīng)用，比如尋常痤瘡、各種皮炎、瘙癢癥、銀屑病等。大麻素化合物各種下游效應(yīng)是通過大麻素受體介導(dǎo)，其中CB2R作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，主要表達(dá)于多種免疫細(xì)胞和組織，也表達(dá)于皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞，參與細(xì)胞增殖、凋亡和免疫調(diào)節(jié)功能。JWH133是一種合成的CB2R激動(dòng)劑，與其受體結(jié)合在細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)方面能產(chǎn)生負(fù)性效應(yīng)，由于該化合物具有特異性高且無成癮的特點(diǎn)，近年來已廣泛應(yīng)用于抗腫瘤以及抑制炎癥反應(yīng)的研究[3]。在模擬治療小鼠黑素瘤的實(shí)驗(yàn)中，在體內(nèi)和體外激活CB2R均能抑制腫瘤的生長，這可能是通過抑制Akt的活化來促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制蛋白（retinoblastoma protein，pRb）磷酸化，從而使細(xì)胞周期停滯于G1～S期[4]。Bettiga等[5]認(rèn)為，CB2R激活后能夠通過下調(diào)Akt表達(dá)，使其下游caspase3活化的機(jī)制誘導(dǎo)了膀胱癌細(xì)胞株的凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測JWH133對HaCaT細(xì)胞體外增殖產(chǎn)生了抑制作用，體現(xiàn)了JWH133對HaCaT細(xì)胞抑制的時(shí)間和濃度依賴特性。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，不同濃度JWH133均能誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的凋亡。筆者推測，在檢測細(xì)胞增殖、凋亡實(shí)驗(yàn)中Akt信號(hào)通路可能成為JWH133作用的一個(gè)共同靶點(diǎn)。

TNF-α是在炎癥反應(yīng)過程中扮演了多種信號(hào)通路激活的激發(fā)者，被認(rèn)為是銀屑病等炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起到非常重要作用的細(xì)胞因子之一[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過TNF-α處理體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞誘導(dǎo)類似銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥模型?？贵w芯片檢測技術(shù)具有高通量、高敏感度、平行性，能比較準(zhǔn)確地反映蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化等特點(diǎn)，目前已成為定性和定量檢測生物樣品中蛋白質(zhì)分子的重要檢測手段之一[7]?？贵w芯片檢測結(jié)果顯示，JWH133能不同程度抑制由TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中IL-19、IL-22及IL-23的表達(dá)，且通過ELISA法驗(yàn)證了芯片檢測結(jié)果的可靠性（P均＜0.05）。筆者推測JWH133可能通過CB2R/JNK及CB2R/STAT3信號(hào)通路直接或間接下調(diào)IL-23及IL-22的表達(dá)，而IL-23和IL-22的抑制又能減少IL-19的產(chǎn)生。IL-19是IL-10家族的細(xì)胞因子之一，IL-19能夠在角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞中表達(dá)，通過與其受體復(fù)合物（IL-20Rα/IL-20Rβ）的結(jié)合導(dǎo)致下游STAT3的激活，可直接引起角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和異常分化以及細(xì)胞因子的表達(dá)。另外，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的IL-19也能夠上調(diào)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[8]。IL-22也是IL-10家族成員之一，具有與IL-19相似的序列和結(jié)構(gòu)的特征，IL-22能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生IL-19，在銀屑病患者皮損處以及血清中發(fā)現(xiàn)IL-22過量表達(dá)，并且同樣是激活下游的STAT3 形成銀屑病的發(fā)病機(jī)制。全基因組關(guān)聯(lián)分析研 究（genome-wide association studies，GWAS） 表明，即在銀屑病有關(guān)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，IL-22對銀屑病皮損的作用通過IL-17和TNF-α的協(xié)同作用進(jìn)一步增強(qiáng)。IL-23是由p19和p40組成異源二聚體細(xì)胞因子，能夠激活JAK/STAT3信號(hào)通路增加IL-22的表達(dá)，在IL-23依賴性皮膚炎癥和表皮增生模型中，IL-23能誘導(dǎo)小鼠皮膚IL-19表達(dá)，這3種因子之間相互聯(lián)系，形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)共同參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展[9,10]。Correa等[11]用N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）能夠通過JNK MAPK信號(hào)通路抑制LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的人神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞株中IL-23的表達(dá)，這些作用部分由CB2R激活介導(dǎo)的。最新研究發(fā)現(xiàn)，GPCRs與STAT3之間可能形成一種信號(hào)級(jí)聯(lián)參與腫瘤相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[12]。另外，有大量相關(guān)文獻(xiàn)記載，leptin、LIF、MCP-1、MIF、CD147這些炎性因子均能參與銀屑病的病理過程[13-17]，本研究抗體芯片檢測結(jié)果表明，在HaCaT細(xì)胞中能被TNF-α誘導(dǎo)表達(dá)增加的這些免疫分子可被JWH133不同程度地抑制。由此可見，銀屑病不是單一某個(gè)因素作用的結(jié)果，而是一種免疫介導(dǎo)、多基因作用又相互聯(lián)系的復(fù)雜性皮膚疾病。

綜上所述，大麻素2型受體激動(dòng)劑JWH133能抑制HaCaT細(xì)胞體外增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且在TNF-α誘導(dǎo)形成的銀屑病炎癥模型下能夠抑制IL-19、IL-22及IL-23的 分 泌， 可 能 下 調(diào)leptin、LIF、MCP-1、MIF、CD147一些重要免疫分子的表達(dá)。本文對JWH133在HaCaT細(xì)胞中作用的研究處于一個(gè)初步探索的階段，存在一定的局限性，但其今后能否成為治療銀屑病的藥物尚需要進(jìn)一步研究。