養(yǎng)肺解郁方對非小細胞肺癌伴抑郁小鼠的抗抑郁作用研究

余 達，邵莉莉，張凌燕，劉中良，田義洲

0 引言

非小細胞肺癌(NSCLC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，占所有肺癌病例的近80%[1]。盡管幾十年來NSCLC的診斷和臨床治療取得了一定進展，但NSCLC患者的5年總生存率約為15%，復發(fā)率仍然很高[2]。肺癌的診斷和治療通常會導致包括抑郁在內(nèi)的負面情緒。抑郁癥是一種精神疾病，其特征是普遍的低情緒和失去對正?；顒拥呐d趣，并且是最常見的精神疾病，終身患病率為10%～20%[3]。研究表明，抑郁癥在腫瘤患者中的發(fā)病率可達10%～30%，是正常人發(fā)病率的3～5倍[4]，嚴重影響NSCLC患者的生活質(zhì)量，甚至降低治療效果和生存率。此外，抑郁特別是重癥抑郁可改變體內(nèi)的激素水平，影響免疫功能，降低對腫瘤的免疫作用，從而間接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后。養(yǎng)肺解郁方能夠有效緩解NSCLC 患者的抑郁情緒，延長中位生存期和抑制抑郁可能導致的過早化療耐藥[5]。本研究觀察了養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行為及其炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物來源 細胞株為具有高自發(fā)肺轉(zhuǎn)移潛能的Lewis肺癌瘤株，移植100%，來源:國家實驗細胞資源共享平臺(China infrastructure of cell line resource)。實驗動物為8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重20～24 g，40只，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。實驗動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(滬)2017-0005。

1.2 藥物、主要試劑及儀器

1.2.1 藥物 養(yǎng)肺解郁方：南北沙參(各)12 g，黃芪15 g，防風6 g，浙貝母6 g，白術(shù)9 g，蒼術(shù)9 g，薏苡仁15 g，石上柏15 g，全蝎3 g，郁金15 g，玫瑰花6 g，梅花6 g，合歡皮15 g，夜交藤30 g。惡心嘔吐加鳳凰衣6 g、竹茹9 g；腹瀉加山藥15 g、芡實9 g；便秘加望江南30 g、玄參15 g；熱毒蘊肺加鴨跖草30 g、黃芩9 g；咳血加生蒲黃6 g、白茅根30 g、白芥子9 g、僵蠶6 g。所有中藥飲片均由舟山中醫(yī)院制劑中心按照國家藥典標準提供。將混合物在100 ℃蒸餾水中煎煮2次，30 min，合并提取液，藥物溶液按2個YFJY治療組(YFJY-0.2 g生藥/ml和YFJY-0.1 g生藥/ml)進行濃縮，濃縮液灌胃給藥，每只小鼠1 ml。

1.2.2 主要試劑與儀器 TNF-α、IL-6、BDNF酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。CREB、BDNF、NF-κB抗體購自美國Abcam 公司。小鼠曠場實驗裝置(30 cm×30 cm×30 cm)，莫里斯水迷宮裝置(江蘇賽昂斯生物科技有限公司)，Noldus ethovision XT裝置(上海仁科生物科技有限公司)，酶標儀(Thermo FisherMK3型，上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 分組、造模及給藥 除對照組外，其余各組均采用CUMS法構(gòu)建抑郁癥模型。在21 d模型制作周期中，每天給小鼠1 種應(yīng)激。應(yīng)激方式包括：足底電擊(2次/min，30 min)，強迫冷泳(4 ℃，5 min)、熱應(yīng)力(45 ℃，5 min)、水平振蕩(30 min)、夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)和晝夜顛倒。應(yīng)激原以隨機順序施加，同一應(yīng)激方式不連續(xù)應(yīng)用。除對照組小鼠外，模型組小鼠均在CUMS后于右腋下皮下接種1 × 107個LL/2細胞。CUMS + YFJY(10 g/kg，5 g/kg)組模型制作期間第1天開始分別灌胃相應(yīng)濃度的YFJY，其余兩組灌胃蒸餾水，3次/d。建模完成后，正常組小鼠每籠5只，接受CUMS小鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食飼料與水，室溫20～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照周期12 h。種瘤第17日進行蔗糖偏好測試，第19日進行曠場測試，第21日進行強迫游泳實驗。行為學實驗結(jié)束后，摘眼球取血和斷頸取海馬組織進行后續(xù)實驗，小心剝離皮下腫瘤組織并稱重。每周進行小鼠體重和腫瘤體積測量和記錄。

1.4 試驗方法

1.4．1 蔗糖偏好試驗 所有小鼠在12 h的食物和水分缺乏后單獨關(guān)在籠子里(28 cm×17 cm×14.5 cm)。然后，給所有小鼠2瓶水或2%蔗糖溶液。蔗糖和水瓶被隨機放置在籠子的兩側(cè)。6 h后，測量水和蔗糖的消耗量。根據(jù)蔗糖偏好度，計算大鼠對蔗糖的偏好，即2%蔗糖溶液(g)占總液體攝入量(g)的百分比 [蔗糖溶液/(蔗糖溶液+水)×100%]。

1.4.2 曠場試驗 開場箱(30 cm×30 cm×30 cm)，分為25個等面積正方形。將小鼠放置場的中央?yún)^(qū)域。在5 min的觀察期內(nèi)，所有小鼠的運動都由連接到迷宮視頻成像軟件(Stoelting Co，Wood Dale，IL，USA)的計算機的攝像頭記錄下來。在對每只小鼠進行測試后，用75%乙醇清潔表面。記錄小鼠經(jīng)過的格數(shù)作為水平活動得分，前肢離體站立的次數(shù)作為垂直活動得分。

1.4.3 強迫游泳試驗 通過將大鼠置于1個圓筒[60 cm(高)×25 cm(直徑)]中，在24～25 ℃溫度下水深30 cm進行FST。FST模型包括2個部分：最初的1 h預(yù)試驗適應(yīng)，隨后進行4 min試驗，統(tǒng)計小鼠不動的時間。當小鼠保持漂浮在水面，只有輕微的動作才能使頭部保持在水面以上，停止掙扎，定義為不動時間。

1.4.4 ELISA 行為學實驗 結(jié)束后，進行眼眶取血，然后斷頸取海馬組織，用RIPA 組織裂解液裂解，超聲粉碎勻漿機勻漿，離心后取上清，根據(jù)說明書步驟用ELISA試劑盒檢測血清中TNF-α、IL-6以及海馬組織中BDNF的濃度。

1.4.5 Western blot 使用含PMSF的RIPA裂解液提取組織中總蛋白，冰上孵育30 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液。BCA試劑盒制樣。上樣，電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜2 h、封閉，滴加一抗(BDNF,CREB,p-CREB,NF-κB，p-NF-κB)，4 ℃孵育過夜后加入相應(yīng)的二抗。隨后滴加適量的ECL 顯色液上機檢測，最后用Image J 軟件檢測條帶吸光度(A)值，以相應(yīng)蛋白條帶的灰度值/β-actin蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠體重的影響 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠體重影響的周變化如圖1 所示，對照組小鼠體重一直呈上升的趨勢。模型組、YFJY-10 g/kg組和YFJY-5 g/kg組小鼠體重在前3周差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在隨后的3周，YFJY-10 g/kg組和YFJY-5 g/kg組小鼠體重顯著高于模型組(P<0.05)。養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠實驗前后體重變化如圖2所示，體重差值=第42天體重-第1天體重，與正常組相比，模型組小鼠體重增長相對緩慢(P<0.01)。與模型組比較，YFJY組小鼠體重增長較快，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠體重的影響

圖2 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠實驗前后體重變化的影響

2.2 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠行為的影響 在蔗糖偏好試驗、曠場試驗和強迫游泳試驗中，與對照組比較，模型組小鼠蔗糖水偏好度、水平運動得分、垂直運動得分顯著降低，游泳不動時間顯著增加(P<0.01)，即小鼠出現(xiàn)明顯的抑郁行為，表明小鼠CUMS模型構(gòu)建成功。與模型組小鼠相比，YFJY-10 g/kg組和YFJY-5 g/kg組小鼠水平運動得分、垂直運動得分明顯增加(P<0.05)，游泳不動時間縮短(P<0.05)，說明養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行為有顯著改善作用。見圖3～圖5。

圖3 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠蔗糖偏好度的影響

圖4 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠曠場試驗的影響

2.3 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠血清TNF-α、IL-6和海馬組織中BDNF表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α 和IL-6 含量顯著增加，海馬組織中的BDNF含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，YFJY-10 g/kg組和YFJY-5 g/kg組小鼠血清和海馬組織中TNF-α 和IL-6 含量顯著減少，海馬組織中BDNF表達顯著增加(P<0.05)，見圖6～圖8。

圖5 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠游泳不動時間的影響

圖6 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠血清中TNF-α的影響

圖7 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠血清中IL-6的影響

圖8 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠海馬組織中BDNF的影響

2.4 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠NF-κB/CREB/BDNF信號通路的影響 如圖9所示，與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中BDNF蛋白表達和CREB的磷酸化顯著減少，海馬組織中NF-κB的磷酸化明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，YFJY-10 g/kg組和YFJY-5 g/kg組小鼠海馬組織中BDNF蛋白表達和CREB磷酸化顯著增加，海馬組織中NF-κB磷酸化明顯減少。

2.5 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠皮下腫瘤重量和體積的影響 與模型組相比，YFJY組皮下腫瘤重量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖10。隨著時間的增加，3組小鼠腫瘤體積均有所增加，其中YFJY-10 g/kg組和YFJY-5 g/kg組皮下腫瘤重量增加速度顯著低于模型組(P<0.05)。

3 討論

抑郁癥是一種復雜的精神疾病，世界衛(wèi)生組織通報全球超過3億人患有抑郁癥，導致嚴重的健康問題[6]。流行病學研究表明，抑郁與癌癥死亡率有關(guān)[7]，因此，研究抑郁癥與腫瘤進展相關(guān)的生物學途徑和確切機制，對于癌癥患者的治療可能有重要作用。在實驗室動物中，CUMS經(jīng)常被用來模擬不可預(yù)知的生活壓力，這些壓力源可能會導致人類出現(xiàn)嚴重的抑郁癥。本研究中，大鼠在CUMS后表現(xiàn)出典型的快感缺失行為，活動探索能力減弱和絕望行為，表現(xiàn)為蔗糖偏好試驗中蔗糖偏好度降低，曠場試驗中水平運動得分和垂直運動得分降低，強迫游泳試驗中不動時間增加，表明抑郁大鼠模型建立成功。養(yǎng)肺解郁方可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化，對NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行為起到干預(yù)作用。

鑒于炎癥可能在抑郁癥中起作用，抗炎劑可能是一種有用的抗抑郁藥物或傳統(tǒng)療法的佐劑。養(yǎng)肺解郁方中的成分如雞血藤、黃芪等，能夠下調(diào)炎癥誘導的生物標志物，包括促炎介質(zhì)(IL-1β，IL-6，TNF-α)，上調(diào)抗炎蛋白(IL-10)的表達，并抑制NF-κB的激活[8-9]。作為一種誘導細胞因子表達并調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB在應(yīng)激期間增加海馬和額葉皮質(zhì)中的IL-1β和TNF-α表達，并且在海馬中調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生，與抑郁癥密切相關(guān)[10]。養(yǎng)肺解郁方顯著逆轉(zhuǎn)模型小鼠血清中IL-6和TNF-α濃度的增加,抑制了NF-κB炎癥信號。因此，養(yǎng)肺解郁方的抗抑郁活性可能與NF-κB介導的抗炎作用機制有關(guān)。

盡管目前應(yīng)激反應(yīng)中涉及的分子和機制尚不明確，但越來越多的證據(jù)表明，BDNF降低是抑郁癥的關(guān)鍵病理生理學標志[11]。BDNF是腦中最普遍的神經(jīng)營養(yǎng)因子，參與神經(jīng)元的增殖、發(fā)育、分化和成熟[12]。BDNF通過CREB介導的過自身磷酸化機制增加自身的轉(zhuǎn)錄并負責神經(jīng)元的存活、維持和生長[13]。抑郁癥患者的血清、血漿和海馬BDNF水平降低，血清BDNF水平降低可能是提示抑郁發(fā)生的指標[14]。另一方面，一些抑郁癥的動物模型也顯示腦區(qū)域中BDNF的表達減少[15]。最近的研究表明，NF-κB信號通路可以抑制CREB蛋白的磷酸化和BDNF的表達[16-17]。本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)肺解郁方治療可以逆轉(zhuǎn)模型組小鼠血清中BDNF水平的降低，增加模型組小鼠海馬組織中CREB的磷酸化和BDNF蛋白的表達?？紤]到BDNF與NF-κB通路的關(guān)系，推測養(yǎng)肺解郁方導致BDNF表達上調(diào)可能是由于其對NF-κB通路的影響。

圖9 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠NF-κB/CREB/BDNF信號通路的影響

注：A.Western blot檢測蛋白表達水平，B.BDNF/β-actin 的定量分析，C.p-CREB /CREB的定量分析，D.p-NF-κB/NF-κB的定量分析。

與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

圖10 養(yǎng)肺解郁方對NSCLC伴抑郁小鼠皮下腫瘤質(zhì)量和體積的影響

NF-κB可以促進腫瘤細胞增殖、存活、轉(zhuǎn)移、炎癥、侵襲、血管生成和對化療和放療的抗性，在肺癌中通常存在NF-κB的異常激活[18]。鑒于NF-κB 可能作為同時激活抑郁與腫瘤的信號，以及近來的文獻研究結(jié)果顯示，養(yǎng)肺解郁方可以通過緩解抑郁來減輕抑郁狀態(tài)對晚期NSCLC中位無疾病進展生存時間的影響，延緩抑郁可能導致的過早化療耐藥[5,19]。因此，養(yǎng)肺解郁方可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號對腫瘤產(chǎn)生作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)肺解郁方能夠明顯減緩NSCLC伴抑郁小鼠皮下腫瘤的生長，表現(xiàn)為腫瘤體積和重量顯著低于模型組，進一步佐證了養(yǎng)肺解郁方緩解抑郁并減緩NSCLC進展的作用。

綜上所述，養(yǎng)肺解郁方可以明顯改善NSCLC伴抑郁小鼠的抑郁行為和相關(guān)指標，減少炎癥因子水平，抑制皮下腫瘤的生長，其機制可能是抑制NF-κB介導的炎癥信號，并促進CREB/BDNF信號級聯(lián)。因此，本研究可能為NSCLC伴抑郁癥的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。